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目的构建并鉴定铜绿假单胞菌rBb-OprF疫苗；分析和检测重组质粒的表达效率和重组蛋白OprF的免疫原性；采用4种不同接种途径疫苗免疫小鼠后，用PAO1菌株攻击，计数实验动物（BALB/c小鼠）肺组织Pa菌荷量，观察血清IgG及其亚类、IgA和IgE的变化；通过检测小鼠脾细胞增殖情况、CD4~+和CD8~+T亚群数量、脾细胞培养上清液中CK (IFN-γ、IL-12、TNF-α和IL-10)的变化和脾细胞凋亡情况，从而初步阐明rBb-OprF疫苗的保护性免疫机制，为Pa疫苗的研制提供有价值的理论资料。方法1、疫苗构建以铜绿假单胞菌标准株PAO1的总RNA为模板，通过RT-PCR扩增获得OprF抗原编码基因序列，用PCR扩增oprF27-1032目的基因片段，定向克隆入pGEX-1LambdaT穿梭质粒中GST标签下游的MCS，构建重组表达质粒pGEX-OprF；将重组质粒pGEX-OprF转化感受态大肠杆菌BL21（DE3），经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达；用PCR鉴定和测序分析序列正确后用电穿孔法将重组质粒pGEX-OprF导入Bb，构建铜绿假单胞菌重组Bb-OprF疫苗，在mRNA水平检测其表达情况。用SDS-PAGE对pGEX-oprF在大肠杆菌BL21（DE3）中经IPTG诱导1～13h表达的目的蛋白进行分析，并用Western blot对重组OprF蛋白进行免疫原性鉴定。2、保护性免疫机制为了研究铜绿假单胞菌rBb-OprF疫苗对BALB/c小鼠急性Pa肺炎的保护作用，设计将56只雌性、清洁级的BALB/c小鼠按不同免疫途径随机分为7组，每组8只。A组: rBb-OprF疫苗皮下注射(SC)，将5×10~6CFU疫苗悬浮于100μL的MRS液体培养基，背部皮下注射1次；B组：rBb-OprF肌肉注射(IM)，将5×10~6CFU的疫苗悬浮于100μL的MRS液体培养基，对小鼠后腿股四头肌注射1次；C组：rBb-OprF鼻腔粘膜接种(IN)，将5×10~5CFU的疫苗悬浮于100μL的MRS液体培养基，鼻腔黏膜接种1次；D组：rBb-OprF口服灌胃接种(PO)，将5×10~8CFU的疫苗悬浮于100μL的MRS液体培养基，口服灌胃1次；E组：空载体对照组(Ca)，将5×10~6CFU的Bb(pGEX-1LambdaT)悬浮于100μL的MRS液体培养基，背部皮下注射1次；F组：Bb对照组(Bb)，将5×10~6CFU的Bb悬浮于100μL的MRS液体培养基，背部皮下注射1次；G组：MRS对照组(MRS)，100μL的MRS液体培养基，背部皮下注射1次。各组按上述接种BALB/c小鼠后8w，乙醚麻醉，用弯曲接种针吸50μL的109CFU/mL的浮游PAO1菌株，从鼻腔注入。在PAO1株鼻腔感染攻击后1w，收集血清和脾细胞，用经典的ELISA法检测各组小鼠血清特异性的IgG及其亚类、IgA和IgE抗体水平；用MTT比色法检测脾细胞原液或PaAg刺激后细胞增殖水平变化；利用FCM检测脾细胞CD++4和CD8亚群变化；用ELISA法检测脾细胞原液或PaAg刺激后培养上清液中IFN-γ、IL-12、TNF-α和IL-10的水平以及用AnnexinV-FITC试剂盒检测脾细胞凋亡率。结果采用RT-PCR扩增出1016bp的OprF编码基因；成功构建pGEX-OprF重组质粒，经双酶切鉴定，切出4947bp的载体片段和1016bp的目的基因片段；序列分析发现其与预期结果一致；以rBb抽提质粒为模板进行PCR扩增可得到1016bp的oprF基因片段，以阳性rBb的总RNA为模板进行RT-PCR扩增，产物经1.2%的琼脂糖凝胶电泳鉴定，可见一条约1016bp的条带，证明外源基因oprF能够在Bb中表达mRNA。SDS-PAGE分析表达产物分子质量约为61kDa，与预期结果一致，表达的目的蛋白质占菌体总蛋白的16%；Western blot鉴定结果重组蛋白能被Pa外膜粗抗原免疫小鼠血清识别，提示重组OprF抗原与天然OprF蛋白具有相同的抗原性，成功构建铜绿假单胞菌rBb-OprF疫苗。rBb-OprF疫苗免疫后8w，用50μL的10~9CFU/ml的浮游PAO1菌株鼻腔内感染攻击后1w检测：（1）疫苗组肺Pa荷菌量：SC组、IM组、IN组和PO组肺组织Pa菌荷量均低于MRS对照组，SC组与IM组、IN组和PO组间存在差异；空载体、Bb和MRS对照组间差异无统计学意义。（2）ELISA法检测血清抗体结果：疫苗免疫组血清IgG、IgG1、IgG2a和IgG2b水平显著增加；皮下注射组和口服灌胃组IgG3水平显著增加；皮下注射组IgA水平增加；疫苗免疫组IgE水平无明显变化。（3）MTT法检测的小鼠脾淋巴细胞增殖结果:所有疫苗接种组脾T细胞增殖明显，SC组和IM组高于IN组和PO组。（4）流式细胞仪检测脾CD4+T细胞和CD8+T细胞结果：各疫苗组脾细胞CD+4T细胞和CD+8T细胞显著增加；CD4+T细胞在SC组最高，CD+8T细胞在SC组、IM组和IN高于PO组。（5）应用Annexin V-FITC kits检测小鼠脾细胞凋亡结果：疫苗接种组脾细胞凋亡发生率降低，SC组低于IM组、IN和PO组。结论通过RT-PCR成功扩增出OprF抗原编码基因；成功构建铜绿假单胞菌rBb-OprF疫苗；重组质粒pGEX-OprF能在大肠杆菌BL21中表达，表达效率较高，重组融合蛋白具有与天然OprF蛋白相同的抗原性；rBb-OprF疫苗能诱导BALB/c小鼠产生较强的保护性免疫反应，皮下和肌肉注射接种是较好的接种途径；铜绿假单胞菌rBb-OprF疫苗可诱导小鼠产生混合型的Th1和Th2免疫应答。