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背景及目的药物性牙龈增生(Drug-induced gingival overgrowth,DGO)是因长期服用抗癫痫药、钙离子通道阻滞剂或免疫抑制剂引起的病理性的牙龈体积肥大,以牙龈成纤维细胞的增生及细胞外基质堆积为特点。目前其发病的分子机制尚未完全阐明,因而缺乏有效的药物治疗。近年来,转谷氨酰胺酶2(Transglutaminase 2,TG2)因作为信号分子参与纤维化病变的发生和发展而备受关注。已有研究发现钙离子拮抗剂硝苯地平(Nifedipine,NIF)刺激的大鼠牙龈组织中TG2的表达水平及活性明显升高,因此本研究体外条件下用NIF刺激人牙龈成纤维细胞,通过检测NIF作用过程中TG2表达、活性及相关因子的表达,以确定TG2在药物性牙龈增生中的作用,为探索以TG2为靶点的药物治疗提供一定的理论支持。实验方法1、采集临床上健康的成人牙龈,用酶消化联合组织块培养法分离培养人牙龈成纤维细胞；免疫化学方法进行牙龈成纤维细胞鉴定。2、运用MTT法绘制人牙龈成纤维细胞生长曲线,用第三代人牙龈成纤维细胞,检测人牙龈成纤维细胞在0μg/ml、0.6μg/ml、0.8μg/ml.1.0μg/ml、1.5μg/ml、 2.0μg/ml浓度的NIF作用24h的增殖情况,以确定NIF的最适刺激浓度。3、流式细胞术检测人牙龈成纤维细胞在NIF刺激下细胞内钙离子浓度变化。4、微量滴定板技术检测人牙龈成纤维细胞在1.0 μ g/ml NIF刺激情况下TG2蛋白活性。5、在培养的人牙龈成纤维细胞中同时加入10μg/ml的NIF及0μmol/L.50 μmol/L.100μmol/L.150μmol/L.200μmol/L及250μmol/L浓度的MDC作用24h,用MTT法确定MDC的合适作用浓度.6、根据以上实验结果,将细胞分为以下几组后,采用Western Blot技术检测人牙龈成纤维细胞药物刺激24hTG2及α-SMA蛋白水平的表达。采用Real-time PCR技术检测人牙龈成纤维细胞药物刺激24h后TG2及α-SMA基因表达。空白对照组C组：DMEMNIF组 A组：DMEM+1.0μg/ml NIFMDC组 B1组：DMEM+1.0μg/ml NIF+50μmol/L MDCB2组：DMEM+1.0μg/ml NIF+100μmol/L MDCB3组：DMEM+1.0μg/ml NIF+150μmol/L MDC7、统计学分析：所有实验结果数据采用SPSS20.0统计学软件分析,两独立组间样本差异比较用t检验,多个独立样本的显著性检验运用单因素方差分析,p小于0.05被认定具有统计学意义。实验结果一、酶消化联合组织块原代培养法分离培养的人牙龈成纤维细胞,2天左右有细胞从组织块游出,传代后在倒置显微镜下细胞呈梭形,条索状、旋涡状排列,高倍镜下细胞核呈圆形,核仁清晰。细胞免疫化学法检测见培养的细胞角蛋白阴性表达,波形蛋白阳性表达。二、MTT结果显示：生长曲线发现24h后人牙龈成纤维细胞生长即进入平台期。细胞在一定浓度的NIF(0.6-2.0μg/ml)作用下,其增殖能力有不同程度的提高,1μg/ml NIF的促细胞增殖作用最好；将MDC按照50-250 μ mol/L浓度加入1μg/mlNIF刺激的牙龈成纤维细胞中,发现MDC抑制成纤维细胞增殖,且具有浓度依赖性,100μmol/L MDC的抑制效果最佳,与空白对照组差异明显(p<0.05)发现MDC在50-150μmol/L范围内抑制成纤维细胞增殖,对细胞形态无明显影响,200 u mol/LMDC具有明显的细胞杀伤作用,细胞生长增殖受到明显抑制。三、流式细胞术检测结果显示,空白对照组细胞钙离子荧光含量为6815±79.02,而加入NIF刺激后钙离子荧光含量明显增加至11926±131.64。四、微量滴定板法检测加入NIF刺激前后牙龈成纤维细胞内TG2的蛋白活性,结果显示空白对照组OD值为0.13±0.05,而加入硝苯地平后的0D值为0.334±O.12,有统计学意义(p<0.05)。五.Western Blot显示1μg/ml NIF作用人牙龈成纤维细胞后,TG2及α-SMA的表达水平均明显高于空白对照组,加入梯度浓度MDC作用后,TG2及α-SMA蛋白的表达随MDC浓度增高逐渐降低,显著低于NIF组。六、Real-time PCR显示：NIF作用后人牙龈成纤维细胞中TG2的m-RNA较空白对照组明显增高,加入MDC后,TG2的m-RNA表达水平降低,且随MDC浓度增高其下降更加明显。在加入NIF刺激后,α-SMA的m-RNA表达水平增高近5倍,加入50μ mol/L浓度的MDC后,α-SMA的m-RNA水平较NIF刺激组明显降低,但随着MDC浓度的增加,α-SMA的m-RNA水平变化不大。结论1.本实验研究表明一定浓度范围的硝苯地平在体外条件下可以促进人牙龈成纤维细胞的增殖。从而提示药物性牙龈增生的发病可能与钙离子拮抗剂促进牙龈成纤维细胞增殖有关。2.硝苯地平刺激后,人牙龈成纤维细胞内游离钙离子浓度明显升高,这可能是硝苯地平导致牙龈增生的启动点。3.在药物性牙龈增生发病过程中,钙离子依赖的TG2表达增加,酶活性增强,并且促使牙龈成纤维细胞向肌成纤维细胞转化,其抑制剂可显著降低TG2的上述作用,表明TG2在牙龈增生发病机制中具有重要作用,提示TG2可作为药物性牙龈增生疾病的药物治疗靶点。