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肿瘤活疫苗的抗肿瘤免疫效应远强于死疫苗，但目前尚未能应用于肿瘤的临床治疗，主要原因之一在于其进入体内后的致瘤性问题。本研究将自杀基因系统引入肿瘤活疫苗，籍此来控制活疫苗在体内的活性，以期研究开发一种高效而且安全的肿瘤疫苗。本课题分为以下三个部分进行研究：第一部分可控性树突状细胞活疫苗的制备及其免疫生物学特性的鉴定目的：制备可控性大鼠卵巢癌／树突状细胞（Dendritic cell，DC）活疫苗并检测其免疫生物学特性。方法：1．分离大鼠Fischer344骨髓前体细胞，在rrGM-CSF和rrIL-4的联合作用下，培养、扩增大鼠骨髓来源DC：2．以逆转录病毒为载体将自杀基因——Ⅰ型单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶（HSV1-tk）基因转导入大鼠卵巢癌细胞株NuTu-19，并经过G418筛选获得阳性克隆NuTu-19／TK；3．以聚乙二醇法将DC与NuTu-19／TK融合制成卵巢癌／DC活疫苗，活疫苗经30 Gy60Co照射后作为死疫苗。4．分别从形态学（光镜、电镜、激光扫描共聚焦显微镜）、免疫原性相关表型（流式细胞仪）、基因表达（RT-PCR、Western blot）、增殖和凋亡（MTT法、流式细胞仪）以及免疫功能（混合淋巴细胞反应、细胞毒性T淋巴细胞反应）等方面研究此活疫苗的免疫生物学特性。结果：1．每只Fischer344大鼠可收获约5×107个DC。培养第10天的DC呈典型的细而长的树枝状突起，高表达表面分子MHC-Ⅱ（OX6）、共刺激分子B7-2、整合素OX62和粘附分子ICAM-1，能有效地刺激T细胞增殖；2．RT-PCR和Western blot结果显示NuTu-19／TK中有HSV1-tk基因稳定表达；3．细胞融合率为（23.4±13.8）％，融合细胞呈典型的双阳性表现；活疫苗表达HSV1-tk基因，高表达表面分子OX6、B7-2、OX62和ICAM-1；死疫苗的表面分子表达降低（P＜0.05），失去增殖能力，凋亡率显著升高（P＜0.01）；与死疫苗相比，活疫苗能明显刺激T细胞增殖，对亲本肿瘤细胞NuTu-19有显著的杀伤作用（P＜0.01）。结论：卵巢癌／DC活疫苗在体外实验中可诱导产生有效的抗肿瘤免疫效应，为进一步的体内实验提供了实验基础。第二部分可控性树突状细胞活疫苗诱导抗卵巢癌免疫保护和免疫治疗作用目的：研究可控性DC活疫苗诱导抗卵巢癌免疫保护和免疫治疗作用。方法：1．乳酸脱氢酶释放法检测经过活疫苗免疫的大鼠脾细胞毒性T淋巴细胞（CTL）对NuTu-19细胞的杀伤作用。2．在体内免疫保护实验中，实验大鼠分为活疫苗组、活疫苗+羟甲基无环鸟苷（GCV）组、死疫苗组、单用GCV组和PBS对照组。各组大鼠分别经二次免疫后，给予NuTu-19细胞攻击。一周后，活疫苗+GCV组和单用GCV组再予腹腔注射GCV。NuTu-19细胞攻击后90天终止实验。观察肿瘤出现时间、肿瘤大小。分别计算实验各组抑瘤率、病理形态学检测、流式细胞仪检测各肿瘤组织的细胞凋亡情况。3．在体内的免疫治疗实验中，每只大鼠先皮下接种NuTu-19细胞，一周后将荷瘤大鼠分组，分别给予二次活疫苗、活疫苗+GCV、死疫苗、单用GCV或PBS处理。接种NuTu-19细胞后90天终止实验。观察肿瘤形成及肿瘤大小，取瘤称重并作光镜及流式细胞仪检测。结果：1．经活疫苗免疫的大鼠脾CTL对NuTu-19细胞的杀伤活性比PBS对照组显著增高（P＜0.01），并强于经死疫苗免疫者（P＜0.05）。2．免疫保护实验结果表明，与PBS对照组相比，经活疫苗免疫后大鼠的肿瘤发生率降低；成瘤时间延迟；肿瘤体积缩小（P＜0.01），其作用强于死疫苗组（P＜0.05）。活疫苗组抑瘤率可达83.02％，而死疫苗组仅25.47％，差异有显著性意义（P＜0.01）。活疫苗组肿瘤组织有大片坏死灶及大量淋巴细胞浸润；肿瘤组织的凋亡率明显高于对照组（P＜0.05）。3．免疫治疗实验结果表明，与PBS对照组相比，活疫苗治疗组大鼠的平均肿瘤体积明显缩小（P＜0.01）。活疫苗组抑瘤率可达86.24％，而死疫苗组仅34.39％，差异有显著性意义（P＜0.01）。活疫苗组肿瘤组织出现大片状坏死样结构及团簇样淋巴细胞浸润；肿瘤组织的凋亡率明显高于对照组（P＜0.05）。结论：与死疫苗相比，卵巢癌／DC活疫苗能显著提高大鼠CTL杀伤活性，诱导更强的抗卵巢癌免疫保护和免疫治疗作用。第三部分可控性树突状细胞活疫苗的安全性研究目的：研究可控性DC活疫苗在体内外被灭活的可行性。方法：1．在体外实验中，以MTT法检测GCV对活疫苗的杀伤作用；以流式细胞仪和Hoechst染色法检测GCV作用7天后活疫苗的凋亡现象。2．在体内实验中，大鼠经足垫皮下接种活疫苗后分为两组：活疫苗+GCV组大鼠再予GCV腹腔注射7天；活疫苗+生理盐水组作为对照组。接种活疫苗后观察90天，记录注射部位有无肿瘤形成及各脏器的肿瘤转移情况。3．将活疫苗以荧光染料标记后进行大鼠体内示踪，一组大鼠再予腹腔注射GCV 7天，另一组腹腔注射生理盐水。采用末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）介导的d-UTP缺口末端标记技术，对大鼠淋巴组织的冰冻切片作原位细胞凋亡检测，以了解进入体内的活疫苗的凋亡情况。结果：1．在体外GCV对活疫苗的杀伤作用有时间依赖性和剂量依赖性；浓度为100μg／ml的GCV对活疫苗的杀伤率可达88.42％；大于80％的活疫苗发生凋亡，显现细胞核浓缩，边集等现象。2．活疫苗+生理盐水组共有3／5的大鼠注射部位出现低分化腺癌，其中一只有淋巴结和肺部肿瘤转移；而活疫苗+GCV组未见肿瘤形成及转移。3．荧光显微镜下见经红色荧光标记的活疫苗出现在大鼠脾脏，进一步原位细胞凋亡检测显示活疫苗已为凋亡细胞。结论：HSV1-tk／GCV通过诱导肿瘤活疫苗发生凋亡而起到控制其体内外存活状态的作用。总结：携带有自杀基因的卵巢癌／DC融合活疫苗具有高效的抗肿瘤免疫保护和免疫治疗作用，并可经HSV1-tk／GCV系统有效控制疫苗的存活状态，从而增强肿瘤疫苗的安全性。