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研究背景神经损伤或炎症常引起神经病理性痛,主要表现为触觉诱发痛(Allodynia)、痛觉过敏(Hyperalgesia)和自发性痛(Spontaneous pain)。目前机制仍不十分清楚,疗效欠佳,给患者带来极大痛苦。T-LAK细胞来源的蛋白激酶(T-LAK cell originated protein kinase,TOPK)是一种新发现的丝-苏氨酸激酶,参与多种生物学过程,如肿瘤的发生发展、细胞增殖和凋亡、以及炎症等过程。既往研究发现TOPK在睾丸的生殖细胞和几种胎儿组织(包括神经干细胞)中表达;最近有报道TOPK在缺血再灌注大鼠脑中也有表达。TOPK属于丝裂原激活的蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)家族的上游激酶,以往研究已经证明MAPK信号通路激活参与神经病理性痛。因此我们推测TOPK可能与病理性痛的产生有关。但迄今为止,TOPK在痛传导通路背根神经节(Dorsal root ganglia,DRG)和脊髓背角的表达及其在神经病理性痛中的作用尚无任何报道。实验将大鼠腰5脊神经结扎(Lumbar 5 Spinal Nerve Ligation,L5 SNL)作为诱导神经病理性痛的模型,然后测试大鼠的机械刺激撤足阈值和热缩足潜伏期观察大鼠的痛行为学变化。通过免疫荧光组织化学、Western blot、RT-PCR和qPCR等分子生物学技术,观察TOPK在L5 SNL大鼠DRG和脊髓背角的表达变化,结合鞘内微量注射TOPK抑制剂和TOPK siRNA,探讨TOPK在大鼠神经病理性痛中的作用。实验结果进一步的阐明了神经病理性痛的机制并为其提供了新的理论依据,同时也为神经病理性痛的防治提供了新的药物作用靶点。研究结果1.SNL 后总量 TOPK(t-TOPK)和磷酸化 TOPK(p-TOPK)在 DRG和脊髓背角的表达变化随机将大鼠分为对照组(sham组,n=8)和实验组(L5 SNL组,n=8)并进行L5 SNL手术,以术前3天和1天的PWT和PWL为基础值,然后分别于SNL后1、3、5、7、10、14、21和28天检测大鼠的PWT和PWL。结果显示从术后1天开始大鼠的PWT和PWL开始降低,于第7天降到最低,显著性差异维持到了术后28天(与sham组相比,***P<0.001,one-way ANOVA)。与术前基础值比较,对侧PWT和PWL无明显变化,说明模型建立成功。大鼠L5 SNL后,分别在术后1、3、7、14和21天急性处死大鼠,然后取大鼠L4/L5 DRG和脊髓背角,检测t-TOPK和p-TOPK的蛋白含量变化以及t-TOPK mRNA表达量变化。Western blot结果显示,L5 SNL后术侧t-TOPK在DRG和脊髓背角的蛋白量没有明显变化,而术侧p-TOPK在背根神经节和脊髓背角的蛋白表达量升高,并在第3天升到峰值(与control相比,**P<0.01,**P<0.01,one-way ANOVA)。RT-PCR 和 qPCR 结果显示,L5 SNL 后术侧t-TOPK mRNA在DRG和脊髓背角的表达量升高,并在第3天升到峰值(与control 相比,*P<0.05,***P<0.001,one-way ANOVA)。以上结果表明,大鼠L5 SNL引起了 DRG和脊髓背角p-TOPK的蛋白表达量上调和t-TOPK在mRNA水平上调。2.大鼠L5 SNL后t-TOPK及p-TOPK在DRG和脊髓背角表达的细胞类型用免疫荧光组织化学进行验证,免疫荧光单染结果显示L5 SNL术后3天t-TOPK在大鼠术侧背根神经节和脊髓背角中表达量与sham组相比无变化,而L5 SNL术后3天p-TOPK在大鼠术侧背根神经节和脊髓背角中表达量与sham组相比升高。然后,我们利用免疫荧光双染技术发现,在DRG中p-TOPK与A类神经元标志物NF-200和小直径非肽能神经元标志物IB4共存,但与卫星样胶质细胞标志物GFAP无共存。在脊髓背角,p-TOPK与神经元标志物NeuN和星形胶质细胞GFAP共存,但不表达于小胶质细胞。3.术前鞘内注射TOPK抑制剂HI-TOPK-032能减轻L5 SNL引起的神经病理性痛并下调p-p38的表达鞘内注射不同剂量的TOPK抑制剂HI-TOPK-032后,观察L5 SNL后大鼠痛行为学的变化。结果显示,L5 SNL后鞘内注射HI-TOPK-032组的大鼠的PWT和PWL呈剂量依赖性升高。与L5 SNL+Vehicle组相比,L5 SNL+HI-TOPK-032100μg/10 μ1组的PWT在术后第1天开始升高,一直到第5天(***P<0.001,one-way ANOVA);与 L5 SNL+Vehicle 组相比,L5 SNL+HI-TOPK-032 100 μg/10μl组的PWL在术后第3天开始升高,直到第7天(**P<0.01,***P<0.001,one-way ANOVA)。正常大鼠鞘内注射HI-TOPK-032(100 μg/10μl)后的 PWT和PWL与基础值相比没有变化。实验还进一步观察了 TOPK抑制对p38 MAPK的影响,实验分四组,分别为:Naive组、L5 SNL+Vehicle组、L5 SNL+HI-TOPK-032组和Naive+HI-TOPK-032组,分别取不同组的大鼠术侧的DRG和脊髓背角。Western blot结果显示,鞘内注射HI-TOPK-032后DRG和脊髓背角四组间t-TOPK和TOPK下游底物t-p38的蛋白含量没有明显差异;但与对照组比较,L5 SNL+Vehicle组的p-TOPK和p-p38的蛋白含量在背根神经节和脊髓背角均明显升高(*P<0.05,**P<0.01,one-way ANOVA);而这种变化可被鞘内微量注射 HI-TOPK-032 抑制(SNL+HI-TOPK-032 组与 SNL+Vehicle组比较:*P<0.05,**P<0.01,one-way ANOVA)。由以上结果可知,抑制TOPK的活性可以部分抑制神经病理性痛的形成,同时也可以抑制L5 SNL引起的p-p38在背根神经节和脊髓背角中的蛋白表达量上调。4.腰5脊神经结扎后第7天鞘内注射TOPK抑制剂HI-TOPK-032能部分逆转大鼠的痛行为建立L5 SNL模型,进行行为学测试,测试至术后7天,然后连续3天鞘内注射TOPK抑制剂HI-TOPK-032 100 μg/10μ1,重复以上操作,观察大鼠PWT和PWL的变化。结果显示HI-TOPK-032治疗后,大鼠PWT缓慢升高,一直持续到术后 12 天(SNL+HI-TOPK-032 与 SNL+Vehicle 组相比,12 d,*P<0.05,studentt test);大鼠的PWL从术后7天开始缓慢升高,一直持续到术后12天(SNL+HI-TOPK-032 与 SNL+Vehicle组相比,7d,*P<0.05;9 d,***P<0.001;12 d,***P<0.001;student ttest)。以上结果表明,鞘内注射 TOPK 抑制剂HI-TOPK-032可使已经建立起来的神经病理性痛得到部分逆转。5.鞘内注射TOPK siRNA能减轻L5 SNL引起的神经病理性痛为排除药物的非特异性作用,实验还采用鞘内注射TOPK siRNA抑制TOPK的合成,通过测试PWT和PWL观察其对SNL后大鼠的痛行为的作用。结果显示与L5 SNL+Vehicle组相比,鞘内注射TOPK siRNA后大鼠的PWT在术后第1天开始升高,并一直到第5天(1d,*P<0.05;3d,***P<0.001;5 d,*P<0.05,one-way ANOVA);鞘内注射TOPK siRNA后大鼠术侧PWL在术后第1天也显著性的升高,并且一直持续到了术后第3天(1d,**P<0.01;3 d,*P<0.05;one-way ANOVA)。但鞘内注射 Scramble siRNA 组与 L5 SNL+Vehicle组相比则无统计学差异。然后还利用Western blot观察了鞘内注射TOPK siRNA对TOPK以及p-p38在大鼠脊髓背角和DRG中表达的影响,实验分五组:Naive组、L5 SNL+Vehicle 组、L5 SNL+TOPK siRNA 组、SNL+scRNA 组和 Naive+TOPK siRNA组,分别取不同组的大鼠术侧的DRG和脊髓背角。结果显示,TOPK下游底物t-p38的蛋白含量在背根神经节和脊髓背角中没有变化(L5 SNL+TOPK siRNA 与 L5 SNL+Vehicle 组和 SNL+ scRNA 组相比);但 t-TOPK 和 p-p38的蛋白含量在背根神经节和脊髓背角中明显降低(L5 SNL+TOPK siRNA与L5 SNL+Vehicle 组和 SNL-+ scRNA 组相比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,one-way ANOVA)。由以上可知,鞘内注射TOPK siRNA能够部分抑制L5 SNL引起的神经病理性痛的形成,同时也会抑制L5 SNL引起的p-p38在大鼠术侧背根神经节和脊髓背角中的蛋白表达量的上调。6.SNL后第7天鞘内注射TOPK siRNA能部分逆转神经病理性痛的症状TOPK siRNA在模型建立的第七天,开始鞘内注射,连续注射三天。结果显示鞘内注射TOPK siRNA后,大鼠PWT缓慢升高,一直持续到术后9天(L5 SNL+TOPK siRNA 与 L5 SNL+Vehicle 组相比,9 d,*P<0.05,student t test);大鼠术侧PWL也缓慢升高,一直持续到术后9天(L5 SNL+TOPK siRNA与L5 SNL+Vehicle 组相比,7 d,*P<0.05;9 d,***P<0.001;student t test)。以上结果表明鞘内注射TOPK siRNA也可使已经建立起来的神经病理性痛得到部分逆转。结论脊神经损伤通过背根神经节和脊髓背角TOPK/p38信号途径的激活参与了大鼠神经病理性痛的形成和维持。