论文部分内容阅读
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD(H))参与胞内包括氧化还原反应在内的多种生物过程,因此胞内NAD(H)水平受到严格调控。在工业生物技术领域,辅因子调控是提高产量的重要手段。由于尚不了解胞内NAD(H)浓度阈值,并且难以向胞内输送NAD(H),制约了辅因子调控手段的有效性和可预见性。本论文将来源于衣原体Protochlamydia amoebophila UWE25的NAD+转运蛋白NTT4引入大肠杆菌,通过改变胞外NAD(H)浓度精确调控胞内辅因子水平,确定胞内NAD(H)极限浓度,并将其应用于提高全细胞催化氧化还原反应的效率。
首先通过大肠杆菌静息细胞转运以及NAD+生物合成途径阻断驱动转运策略验证了NTT4的功能。发现胞外NAD+对大肠杆菌DH5α、DH10B和AS1.156.6生长有明显促进作用,且确定了其效应基团为AMP部分,而对BW25113生长基本没有影响。
通过预先表达NTT4,阻断NAD+生物合成关键基因nadE或nadD,构建了NAD+营养缺陷型大肠杆菌菌株YJE003和YJE004。并利用YJE003确定了胞内NAD(H)浓度阈值,为野生型细胞的4.4%-960%。发现胞外NAD(H)差异不仅能改变胞内NAD(H)水平,还能调控胞内氧化还原态。
发现辅因子再生对全细胞催化甘油氧化生产二羟丙酮(DHA)的效率至关重要。在辅因子高效再生基础上,表达NTT4将胞内NAD(H)浓度和DHA产量分别提高44%和58%。在摇瓶水平,DHA最高转化率达到84%,生产强度达到0.42 g/gDCW/h。