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研究背景肺癌是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一,其中非小细胞细胞肺癌（NSCLC）是最常见的病理类型,约占85%。尽管过去数十年靶向治疗和免疫治疗取得了巨大进步,对于大多数患者来说,其仍是不可治愈的疾病。基于铂类的化疗以及放疗仍是当前临床应用最为广泛的治疗手段,二者均可通过DNA损伤和复制应激对肿瘤细胞发挥毒性作用。而肿瘤细胞常常存在放疗和化疗抵抗,致使肿瘤局部控制不佳和复发。应对放疗和化疗所致DNA损伤和复制应激时,机体细胞通过启动DNA损伤修复通路以及激活细胞周期检查点、阻滞细胞周期进程以促进损伤修复,亦或通过细胞衰老、凋亡、自噬等途径清除损伤,最终维持机体稳定,这一过程也称为DNA损伤应答（DNA damage response,DDR）。DDR缺陷导致基因突变和重排累积,增加基因组不稳定性,并促进肿瘤的发生发展。但也正因为这些缺陷,而致使肿瘤细胞能够对导致DNA损伤的放化疗干预产生应答,而机体正常细胞则能够应对DNA损伤。大量研究亦证实,DNA损伤修复能力异常增强的肿瘤细胞,能够有效避免DNA损伤导致的细胞死亡并进一步增殖,对放化疗发挥抵抗作用。而多种LncRNA可通过介导DNA损伤修复、细胞凋亡、肿瘤干细胞活性等途径参与了肿瘤的放化疗抵抗。前期课题组团队通过RNA免疫共沉淀与高通量测序技术发现LncRNA PANDAR可以结合DNA修复通路中的关键分子ATR,查阅相关文献发现该LncRNA与DNA损伤存在密切关系。研究内容和方法1.LncRNA PANDAR对NSCLC细胞放疗和化疗敏感性的影响选取NSCLC细胞A549和H1299细胞系,构建PANDAR敲低和过表达的稳转细胞系,设置顺铂处理、γ射线照射处理和空白对照组,通过CCK8、克隆形成率、细胞周期、凋亡实验,在细胞水平探讨PANDAR对非小细胞肺癌细胞放化疗敏感性的影响。2.LncRNA PANDAR调控NSCLC细胞放疗和化疗敏感性的机制PANDAR敲低、过表达、对照组对的细胞系,分别予以顺铂、γ射线和空白处理,通过彗星电泳检测DNA损伤程度、免疫荧光染色和共聚焦显微镜分析技术检测细胞DNA损伤标志γH2AX foci、Western blot检测DDR通路相关蛋白变化情况。3.LncRNA PANDAR对NSCLC裸鼠荷瘤模型放化疗敏感性的影响构建PANDAR敲低的NSCLC裸鼠皮下荷瘤模型,以野生型作为对照组,予以局部照射γ射线、腹腔注射顺铂及空白对照,测量肿瘤生长曲线,并取组织进行免疫组化。通过检测Ki67了解肿瘤增殖情况、TUNEL了解凋亡情况、γH2AX了解DNA损伤程度。通过上述实验,在体内探讨PANDAR敲低对放化疗的增敏效果。研究结果1.LncRNA PANDAR负性调控NSCLC细胞放疗和化疗敏感性在细胞实验中,PANDAR过表达能够增加NSCLC对放疗和化疗的抵抗,即相应的CCK8实验显示肿瘤细胞活性增强、克隆形成率增加、凋亡减少,同时细胞周期进程受阻程度加重以为DNA损伤修复提供时间。而PANDAR敲低后,NSCLC细胞对放化疗的敏感性增强。2.LncRNA PANDAR通过ATR/CHK1通路促进NSCLC细胞放疗和化疗所致的DNA损伤进行修复通过彗星电泳实验,PANDAR敲低后,A549细胞经照射后DNA损伤程度增加,而过表达则相应损伤程度减轻。进一步通过免疫荧光染色和共聚焦显微镜分析技术检测DNA损伤标志γH2AX foci,发现A549和H1299细胞系中PANDAR敲低后,照射组和顺铂处理组γH2AX foci数目均显著增加,而过表达则相应减少。上述实验表明PANDAR能够通过调控细胞DNA损伤进而影响NSCLC对放疗和化疗的敏感性。通过Western blot对DDR通路相关分子检测发现,PANDAR敲低后,照射及顺铂组的ATR、CHK1磷酸化水平受到一定程度抑制,表明PANDAR能够通过ATR/CHK1通路促进DNA损伤修复,从而增加放化疗抵抗。3.LncRNA PANDAR敲低增强了裸鼠NSCLC模型放疗和化疗的敏感性在小鼠A549移植瘤上,经局部γ照射或腹腔顺铂给药处理3周后,可见到PANDAR敲低组相较于野生型组肿瘤体积显著减小,P＜0.01。免疫组化结果可见到敲低组DNA损伤标志γH2AX、TUNEL细胞凋亡染色增强,而代表细胞增殖的Ki67染色减弱。研究结论本研究通过细胞水平及动物模型实验发现PANDAR敲低对NSCLC的放疗和化疗具有增敏作用,并证明了其通过调控DNA损伤修复水平影响放疗和化疗的敏感性。我们的研究发现,PANDAR敲低后能够抑制DNA损伤后ATR/CHK1通路的磷酸化,进而影响NSCLC放疗和化疗的敏感性。该研究提示,PANDAR可能为NSCLC放疗和化疗增敏靶点,为临床肺癌放疗及化疗增敏药物的研发提供了新思路,对改善肺癌患者预后具有重要意义。