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目的:
KBN处方为外治外阴阴道假丝酵母菌病(Vulvovaginal Candidiasis，VVC)的临床验方，制成常规溶液型或乳剂型洗剂载药量低，且对方中有效成分小檗碱及茶树油溶解性差，未能充分发挥处方优势而影响疗效。微乳、微乳凝胶作为一种新型药物载体，载药量高且对难溶性药物具有较好的溶解能力。基于此，本课题制备可同时承载黄连生物碱与茶树油的KBN微乳及微乳凝胶，考察其理化性质及体外释药行为，并通过建立小鼠VVC模型评价其药效，将传统中药方剂与现代制剂结合，以期实现临床验方最佳药效。
方法:
1.KBN微乳、微乳凝胶的制备。以茶树油作为微乳油相，通过考察制剂中小檗碱在表面活性剂与助表面活性剂中溶解度、绘制伪三元相图及测定电导率确定微乳处方及构型，并考察其理化性质，测定小檗碱含量;同时探讨微乳制备工艺对KBN复方有效部位及药效成分的适用性。在此基础上，优选凝胶基质卡波姆-940及羟乙基纤维素的用量，制备KBN微乳凝胶。
2.KBN微乳、微乳凝胶的透皮吸收行为及体外抑菌药效研究。以小檗碱的透皮速率、单位面积累积渗透量等透皮吸收行为指标，采用改良Frans体外扩散池，进行小鼠离体皮肤体外渗透实验，评价KBN微乳、微乳凝胶、触变凝胶的体外透皮吸收效果;并采用打孔法比较KBN微乳、微乳凝胶、触变凝胶、药液对白色念珠菌的抑菌药效。
3.KBN微乳、微乳凝胶治疗小鼠VVC模型药效研究。以白色念珠菌为致病菌建立小鼠VVC模型，通过检测小鼠阴道内菌落数变化，并辅以对阴道组织病理分析，确定给药周期，考察KBN微乳、微乳凝胶对小鼠VVC模型的药效，评价KBN各制剂间药效差异。
结果:
1.KBN微乳、微乳凝胶的制备。筛选所得微乳表面活性剂为曲拉通，助表面活性剂为1，2-丙二醇，表面活性剂与助表面活性剂比例为2∶1。优化KBN微乳制剂处方为:KBN浓缩药液（0.629生药/mL）646.9g、茶树油29.7g、曲拉通215.6g、1，2-丙二醇107.8g。制得微乳平均粒径为12.71nm，多分散指数为0.12，为水包油(O/W)型微乳;载药量为0.40g/mL，盐酸小檗碱含量为3.38mg/mL。所得微乳处方亦适用于大孔树脂精制后KBN有效部位及药效成分小檗碱。
优化KBN微乳凝胶处方为:卡波姆-94013g，丙三醇52g，KBN微乳375g(1.6g生药/mL)，三乙醇胺25g，羟乙基纤维素10g，制备工艺为:卡波姆-940于蒸馏水中溶胀制得2.5％卡波姆空白凝胶，将KBN微乳缓慢加入空白凝胶中，搅拌均匀，再加入羟乙基纤维素搅拌(1200r/min，40℃)至分散均匀，滴加90％三乙醇胺调pH至6.0～7.0，蒸馏水补重至1000g，即得。
2.KBN微乳、微乳凝胶的透皮吸收行为及体外抑菌药效研究。对同等生药浓度下KBN微乳（0.2g生药/mL）、微乳凝胶（0.2g生药/g）、触变凝胶（0.2g生药/g）透皮吸收行为及体外抑菌药效研究结果显示，KBN微乳、微乳凝胶、触变凝胶中小檗碱在8h内透皮速率分别为78.63J/μg·cm-2·h-1、25.09J/μg·cm-2·h-1、26.19J/μg·cm-2·h-1，单位面积累积渗透量分别为612.49±90.02μg·cm-2、196.25±25.65μg·cm-2、224.05±16.09μg·cm-2，透皮吸收百分率分别为38.40±5.66％、24.18±4.16％、16.21±1.47％。提示KBN微乳透皮效果优于KBN微乳凝胶及触变凝胶。
在体外抗白色念珠菌药效上，经打孔法实验，KBN药液、微乳、微乳凝胶、触变凝胶对白色念珠菌抑菌圈分别为:12.26±1.57mm、12.44±0.69mm、13.29±0.84mm、11.73±0.89mm。结果表明KBN各制剂均显示较佳的抑菌作用，然三种制剂与KBN药液间未见明显差异。
3.KBN微乳、微乳凝胶治疗小鼠VVC模型药效研究。考察同等生药浓度下KBN微乳（0.2g生药/mL）、微乳凝胶（0.2g生药/g）、触变凝胶（0.2g生药/g）治疗小鼠VVC模型药效。给药1周治疗后，KBN微乳、微乳凝胶、触变凝胶组小鼠阴道内菌落数分别为51.25±24.71，61.92±33.60，57.83±33.98;病理切片结果显示尚存炎症，且可见白色念珠菌菌丝。经给药3周治疗，KBN微乳、微乳凝胶、触变凝胶组小鼠阴道内菌落数分别为7.50±4.81，5.67±4.08，3.67±2.16，菌落数几近消失，病理切片结果显示炎症明显改善，且无白色念珠菌菌丝存在。因此确定给药周期为3周，且分别于给药后第3、7、14、21天进行菌落数检测。
在此基础上，开展KBN各制剂治疗小鼠VVC模型药效研究。结果表明，经3周给药治疗后，KBN微乳、微乳凝胶、触变凝胶、香莲外洗液、洁尔阴、克霉唑组小鼠阴道内菌落数分别为6.50±4.43、5.60±4.27、6.20±4.37、7.30±4.16、11.10±4.72，3.00±2.40。给药3天后，与模型组相比，KBN各制剂组菌落数均显著降低(P＜0.05)，且给药3、7、14天后，KBN各制剂组显示出优于洁尔阴的药效(P＜0.05);小鼠阴道组织经HE、PAS染色后分析，相比于模型组，各给药组小鼠固有层水肿及炎性细胞浸润现象得到改善，炎症减轻;且无白色念珠菌菌丝存在。
结论:
1.本实验制得KBN微乳及微乳凝胶最大载药量分别为0.40g/mL、0.60g/g，显著高于课题组前期制得载药量为0.20g/g的KBN触变凝胶，有助于解决中药洗剂制剂载药量低及药效成分小檗碱含量少的问题，可为以黄连、黄柏等为主药治疗VVC的洗剂工艺优化提供借鉴;
2.KBN微乳中小檗碱8h内透皮速率及累计透过总量明显高于KBN微乳凝胶及触变凝胶，体现出微乳这一新型给药载体透皮吸收快的剂型优势;
3.KBN微乳、微乳凝胶给药3周对VVC模型小鼠有良好的抑菌、改善局部炎症药效。
KBN处方为外治外阴阴道假丝酵母菌病(Vulvovaginal Candidiasis，VVC)的临床验方，制成常规溶液型或乳剂型洗剂载药量低，且对方中有效成分小檗碱及茶树油溶解性差，未能充分发挥处方优势而影响疗效。微乳、微乳凝胶作为一种新型药物载体，载药量高且对难溶性药物具有较好的溶解能力。基于此，本课题制备可同时承载黄连生物碱与茶树油的KBN微乳及微乳凝胶，考察其理化性质及体外释药行为，并通过建立小鼠VVC模型评价其药效，将传统中药方剂与现代制剂结合，以期实现临床验方最佳药效。
方法:
1.KBN微乳、微乳凝胶的制备。以茶树油作为微乳油相，通过考察制剂中小檗碱在表面活性剂与助表面活性剂中溶解度、绘制伪三元相图及测定电导率确定微乳处方及构型，并考察其理化性质，测定小檗碱含量;同时探讨微乳制备工艺对KBN复方有效部位及药效成分的适用性。在此基础上，优选凝胶基质卡波姆-940及羟乙基纤维素的用量，制备KBN微乳凝胶。
2.KBN微乳、微乳凝胶的透皮吸收行为及体外抑菌药效研究。以小檗碱的透皮速率、单位面积累积渗透量等透皮吸收行为指标，采用改良Frans体外扩散池，进行小鼠离体皮肤体外渗透实验，评价KBN微乳、微乳凝胶、触变凝胶的体外透皮吸收效果;并采用打孔法比较KBN微乳、微乳凝胶、触变凝胶、药液对白色念珠菌的抑菌药效。
3.KBN微乳、微乳凝胶治疗小鼠VVC模型药效研究。以白色念珠菌为致病菌建立小鼠VVC模型，通过检测小鼠阴道内菌落数变化，并辅以对阴道组织病理分析，确定给药周期，考察KBN微乳、微乳凝胶对小鼠VVC模型的药效，评价KBN各制剂间药效差异。
结果:
1.KBN微乳、微乳凝胶的制备。筛选所得微乳表面活性剂为曲拉通，助表面活性剂为1，2-丙二醇，表面活性剂与助表面活性剂比例为2∶1。优化KBN微乳制剂处方为:KBN浓缩药液（0.629生药/mL）646.9g、茶树油29.7g、曲拉通215.6g、1，2-丙二醇107.8g。制得微乳平均粒径为12.71nm，多分散指数为0.12，为水包油(O/W)型微乳;载药量为0.40g/mL，盐酸小檗碱含量为3.38mg/mL。所得微乳处方亦适用于大孔树脂精制后KBN有效部位及药效成分小檗碱。
优化KBN微乳凝胶处方为:卡波姆-94013g，丙三醇52g，KBN微乳375g(1.6g生药/mL)，三乙醇胺25g，羟乙基纤维素10g，制备工艺为:卡波姆-940于蒸馏水中溶胀制得2.5％卡波姆空白凝胶，将KBN微乳缓慢加入空白凝胶中，搅拌均匀，再加入羟乙基纤维素搅拌(1200r/min，40℃)至分散均匀，滴加90％三乙醇胺调pH至6.0～7.0，蒸馏水补重至1000g，即得。
2.KBN微乳、微乳凝胶的透皮吸收行为及体外抑菌药效研究。对同等生药浓度下KBN微乳（0.2g生药/mL）、微乳凝胶（0.2g生药/g）、触变凝胶（0.2g生药/g）透皮吸收行为及体外抑菌药效研究结果显示，KBN微乳、微乳凝胶、触变凝胶中小檗碱在8h内透皮速率分别为78.63J/μg·cm-2·h-1、25.09J/μg·cm-2·h-1、26.19J/μg·cm-2·h-1，单位面积累积渗透量分别为612.49±90.02μg·cm-2、196.25±25.65μg·cm-2、224.05±16.09μg·cm-2，透皮吸收百分率分别为38.40±5.66％、24.18±4.16％、16.21±1.47％。提示KBN微乳透皮效果优于KBN微乳凝胶及触变凝胶。
在体外抗白色念珠菌药效上，经打孔法实验，KBN药液、微乳、微乳凝胶、触变凝胶对白色念珠菌抑菌圈分别为:12.26±1.57mm、12.44±0.69mm、13.29±0.84mm、11.73±0.89mm。结果表明KBN各制剂均显示较佳的抑菌作用，然三种制剂与KBN药液间未见明显差异。
3.KBN微乳、微乳凝胶治疗小鼠VVC模型药效研究。考察同等生药浓度下KBN微乳（0.2g生药/mL）、微乳凝胶（0.2g生药/g）、触变凝胶（0.2g生药/g）治疗小鼠VVC模型药效。给药1周治疗后，KBN微乳、微乳凝胶、触变凝胶组小鼠阴道内菌落数分别为51.25±24.71，61.92±33.60，57.83±33.98;病理切片结果显示尚存炎症，且可见白色念珠菌菌丝。经给药3周治疗，KBN微乳、微乳凝胶、触变凝胶组小鼠阴道内菌落数分别为7.50±4.81，5.67±4.08，3.67±2.16，菌落数几近消失，病理切片结果显示炎症明显改善，且无白色念珠菌菌丝存在。因此确定给药周期为3周，且分别于给药后第3、7、14、21天进行菌落数检测。
在此基础上，开展KBN各制剂治疗小鼠VVC模型药效研究。结果表明，经3周给药治疗后，KBN微乳、微乳凝胶、触变凝胶、香莲外洗液、洁尔阴、克霉唑组小鼠阴道内菌落数分别为6.50±4.43、5.60±4.27、6.20±4.37、7.30±4.16、11.10±4.72，3.00±2.40。给药3天后，与模型组相比，KBN各制剂组菌落数均显著降低(P＜0.05)，且给药3、7、14天后，KBN各制剂组显示出优于洁尔阴的药效(P＜0.05);小鼠阴道组织经HE、PAS染色后分析，相比于模型组，各给药组小鼠固有层水肿及炎性细胞浸润现象得到改善，炎症减轻;且无白色念珠菌菌丝存在。
结论:
1.本实验制得KBN微乳及微乳凝胶最大载药量分别为0.40g/mL、0.60g/g，显著高于课题组前期制得载药量为0.20g/g的KBN触变凝胶，有助于解决中药洗剂制剂载药量低及药效成分小檗碱含量少的问题，可为以黄连、黄柏等为主药治疗VVC的洗剂工艺优化提供借鉴;
2.KBN微乳中小檗碱8h内透皮速率及累计透过总量明显高于KBN微乳凝胶及触变凝胶，体现出微乳这一新型给药载体透皮吸收快的剂型优势;
3.KBN微乳、微乳凝胶给药3周对VVC模型小鼠有良好的抑菌、改善局部炎症药效。