论文部分内容阅读
目的:脑梗死是神经内科常见病、多发病,病死率及致残率很高。早期溶栓是急性脑梗死有效的治疗方法,但是溶栓治疗严格的时间窗使绝大多数患者很难在规定的时间内到医院接受治疗。脑梗死后神经损伤的病理生理机制是比较复杂的级联反应,主要包括兴奋性氨基酸毒性、氧化应激、炎症和凋亡等。缺氧时,谷氨酸兴奋毒作用的关键病理过程之一是钙离子内流引起钙超载。钙超载导致一系列钙依赖性酶被激活,致使自由基产生增加。从而引起线粒体受损、脂质过氧化、ATP匮乏、ROS产生、核酸断裂等,最终导致神经元死亡。线粒体钙浓度与线粒体能量代谢、膜通透性密切相关,也会对胞浆钙信号进行修饰进而影响细胞功能。线粒体钙离子单向转运体(Mitochondrial calcium uniporter,MCU)是新近鉴定出的线粒体内膜上参与线粒体钙摄取的重要结构。MICU1(Mitochondrial calcium uptake1)是MCU的调节蛋白,其对MCU的作用是激活还是抑制,尚且存在争议。由此看来,这种高度复杂而精确的调节作用仍有待深入研究。新近研究表明MCU参与神经细胞谷氨酸兴奋毒,抑制MCU可减少线粒体钙摄取,保护线粒体功能从而减少神经元死亡。因此我们思考MCU、MICU1与脑梗死的相关性,能否通过干预MICU1与MCU的表达来扼制钙超载从而挽救脑梗死中受损细胞?这一新的思路研究期望提供一个脑梗死治疗的新靶点。方法:1采用成年健康雄性Sprague-Dawley大鼠,随机分为正常对照组(control)、假手术组(sham)、大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)组(分为3h、6h、12h、24h、48h、72h六个时间点),应用Longa等的线栓法建立MCAO大鼠模型。术后麻醉清醒后对大鼠进行神经功能评分。在上述不同时间点将动物断头处死,用2%2,3,5-三苯基四唑氮红(triphenyl tetrazolium chloride,TTC)染色法测算脑梗死体积,用蛋白质印迹法(Western Blot)、实时定量荧光聚合酶链式反应(Real-time reverse transcription-quantitative Polymerase Chain Reaction,RT-q PCR)和免疫组化来观察MCU、MICU1、cleaved-caspase3的表达情况,用透射电镜观察细胞及线粒体超微结构变化,用流式细胞分析技术检测线粒体功能。2采用成年健康雄性Sprague-Dawley大鼠,随机分为正常对照组(control)、假手术组(sham)、MCAO 12h组、尤瑞克林+MCAO组(尤瑞克林0.00875PAN/kg+MCAO)。给药组动物梗死后尾静脉注射尤瑞克林0.00875PAN/kg,正常对照组、假手术组和MCAO组给予等容量生理盐水。术后麻醉清醒后对大鼠进行神经功能评分。梗死后12h大鼠断头处死,TTC染色法测算脑梗死体积,用Western Blot来观察MCU及凋亡蛋白cleaved-caspase3的表达情况。结果:1 MCAO组各个时间点可见左侧肢体偏瘫症状,神经功能评分升高(P<0.05)。TTC染色结果显示正常对照组和假手术组大鼠脑组织无白色梗死灶;MCAO组可见右侧大脑半球大面积白色梗死灶。2 Western Blot显示脑梗死6小时MCU、MICU1呈上升趋势,至梗死后12小时,MCU、MICU1表达量达高峰,Cleaved-caspase3表达在脑梗死后3、6、12小时升高显著(P<0.05);免疫组化可见缺血6、12小时后,MCU、MICU1阳性细胞数较正常对照组及假手术组明显增多Realtime-q PCR显示MCU在m RNA水平的表达从梗死后6小时开始升高,至12小时达到高峰(P<0.05),MICU1在m RNA水平的表达在梗死后6-12小时较正常对照及假手术组升高显著(P<0.05)。3电镜下正常对照组和假手术组细胞形态正常,神经元无水肿,细胞核核仁明显,核膜完整,胞浆线粒体、内质网等细胞器完整清晰可见。MCAO后3小时可见脑皮层缺血区神经元胞体肿胀,胞膜完整,线粒体和内质网扩张,核膜模糊,核仁染色质轻度溶解;MCAO后12小时可见胞浆水肿明显,胞膜溶解,出现大量空泡,线粒体水肿明显,内质网溶解,完整细胞器少见,核膜溶解。有的神经元出现凋亡,表现为核染色质边集,胞体变形,胞核固缩。4流式细胞技术检测显示大鼠脑梗死后12-24小时较正常对照组及假手术组线粒体膜电位降低显著(P<0.05)。5尤瑞克林+MCAO组与MCAO12h组相比神经功能评分改善显著(P<0.05);TTC染色显示与MCAO12h组比较,尤瑞克林+MCAO组梗死体积明显缩小(P<0.05);Western Blot可见与假手术组相比,MCAO12h组MCU表达量显著增高(P<0.05),尤瑞克林+MCAO组MCU表达量较MCAO组显著降低(P<0.05),尤瑞克林+MCAO组Cleaved-caspase3表达量较MCAO组及正常对照均显著降低(P<0.05)。结论:脑梗死后脑组织中MCU、MICU1蛋白及m RNA水平表达显著增高,同时期cleaved-caspase3表达增高,细胞凋亡增多,线粒体膜电位降低,表明MCU、MICU1协同作用促进线粒体钙摄取,降低线粒体膜电位,导致线粒体功能损伤,引起钙超载,最终导致细胞凋亡,在大鼠脑梗死引起神经细胞损伤的病理生理过程中发挥着重要的作用,是脑梗死后神经损伤的机制之一。尤瑞克林能改善神经功能缺损状况,减小脑梗死体积。尤瑞克林神经保护机制之一我们认为是通过抑制MCU蛋白表达,减少线粒体钙内流,保护线粒体功能,扼制钙超载,从而抑制细胞凋亡。