TNF／TNFR超家族成员中的CD40／CD40L、OX40／OX40L分子因其在特异性免疫应答中的重要作用和与疾病的密切关系而备受瞩目，成为免疫学中的热点研究领域。本课题以乳腺癌为研究对象，探讨CD40、OX40、OX40L等相关分子在乳腺癌细胞上的表达及其临床意义，并在体外以rhCD40L为激动剂研究CD40信号对乳腺癌细胞株生物学行为的影响，为临床的运用提供实验依据和理论基础；并对OX40L进行了基因克隆、表达和生物学特性研究，为研制具有自身知识产权的鼠抗人单克隆抗体和开展相关研究提供了实验手段。一、CD40及相关分子在乳腺癌中的表达及其生物学意义本研究采用了免疫组织化学方法对58例乳腺癌石蜡切片CD40分子的表达进行检测，发现正常乳腺组织不表达或弱表达CD40分子，而在乳腺癌细胞中均有一定程度的表达，阳性表达率分别为37.9％，与正常乳腺组织的表达有显著性差异(p＜0.01)。由于使用抗体的识别位点不同和检测的样本数量差异，使得CD40在石蜡切片(37.9％)和新鲜标本(50％)中的阳性表达率尽管不同，但都显示CD40的表达与局部淋巴结的转移有关；新鲜肿瘤标本中CD40的表达结果还显示CD40表达与瘤块大小、远处转移有关(p＜0.05)，与皮肤粘连无关(p＞0.05)；在已建株的乳腺癌细胞上CD40表达强阳性(＞90％)。上述结果均表明CD40分子在乳腺癌中的表达，可能参与肿瘤的发生、发展和转移，其临床意义有待进一步研究。组化结果还显示，58例乳腺癌有21例P53阳性表达(36.2％)，与乳腺癌肿瘤分化程度、瘤块大小有关(p＜0.05)，与局部淋巴结转移无关(p＞0.05)。VEGF分子在各种病理类型肿瘤中高表达(81％)，其表达与乳腺癌肿瘤瘤块大小有关(P<0.05)，与分化程度、局部淋巴结转移无关伽>0.05)，同时也与CD4O、P53分子表达无明显相关性。进一步分析，发现乳腺癌中CD40与P53的表达存在一定的相关性(p<0.01，厂0.52)，提示两者在肿瘤的发生、发展中有密切的关系，两者的表达对于乳腺癌的临床评估具有重要的诊断价值，同时在进行以CD40分子为靶分子的生物治疗中要充分考虑到P53基因功能状态。二、CD40信号对乳腺癌细胞株生物学行为的影响 两株高表达CD40的乳腺癌细胞MDA一MB一231、MDA一MB一435细胞，经thCD40L激发后，其HLA一DR分子有不同程度的上调，肿瘤细胞自身高表达CD44和CD54可通过与各自相应配体结合，稳定细胞间接触，增强免疫原性和促进T细胞活化。同时，Rl’- PCR结果显示肿瘤上皮细胞经CD40激发后T细胞活化和趋化因子RANTES的转录水平上调，推测其编码的蛋白可能参与了对T细胞的趋化和活化。因此，肿瘤细胞CD40分子的激发可以促使机体产生有效的抗肿瘤免疫应答，通过粘附分子/共刺激分子上调，改善或纠正T细胞对肿瘤细胞的免疫无能，可以认为这是CD4O信号作用于肿瘤细胞和扩大抗肿瘤效应的间接机制。 我们的实验结果显示rhCD40L影响MDA一MB一231、MDA一MB一35生长抑制和/或凋亡，同时thCD40L可提高肿瘤细胞对化疗药物(阿霉素、轻基喜树碱)和细胞因子(IFN一Y)的敏感性。在本实验中，单用thCD40L、化疗药物、IFN-Y仅导致肿瘤细胞的部分生长抑制，而thCD40L联合化疗药物或IFN一Y则导致更有效的肿瘤生长抑制。细胞周期的检测结果显示MDA一MB一435、MDA一MB一231分别在CD40激发后48、72hr进入Gl期阻滞，不同的细胞周期阻滞的机制尚不完全清楚，推测与细胞生长周期或不同的细胞周期蛋白激酶有关。thCD40L对MDA一MB一231、MDA一MB一35的生长抑制随着thCD40L剂量的增加而增加，这种抑制作用不仅与细胞周期阻滞有关，还与细胞凋亡有关。Pl一A刀nexinV荧光标记方法的结果表明，MDA一MB一35、MDA一MB一231在CD40激发后48hr即出现不同程度的凋亡，MDA一MB一435比MDA一MB一231凋亡显著，这与MDA一MB一35、MDA一MB一231分别在CD40激发后48、72hr进入Gl期阻滞结果相一致，正是Gl期阻滞使得肿瘤细胞不能进入正常的细胞周期而发生细胞凋亡。在基因转录水平上，CD40分子激发使得MDA一MB一435、MDA一MB一231中B瓦习BCL一XL的比率提高。这与早先的研究结果相一致，亦即相对于单独BAX和BCL一XL，B瓦X/BCL一XL的比率与细胞的存活或凋亡更直接相关。CD40分子的激发或配基化可增强肿瘤细胞对化疗药物和细胞因子的敏感性，这为在针对CD40分子靶向治疗肿瘤时，降低临床用药剂量，避免由于大量运用化疗药物而带来的毒副作用提供了实验依据。同时thCD40L分子与化疗药物、细胞因子的协同作.用也为降低rhCD40L的使用剂量避免rhCD40L对相应的全身影响提供了理论基础。 MDA一MB一435细胞高表达CD95分子，CD40信号活化后，尽管没有检测到膜型TNF的改变，但CD120a(TNF甩)、CD95L表达增加，提示该细胞凋亡可能通过CD95(Fas)路径介导凋亡信号，从而引起B瓦X/BCL~XL的比率改变参与对肿瘤细胞生长抑制的调控。MDA一MB一231没有明显的细胞表型改变，我们推测与CD4O信号活化激发的TRAFs谱改变有关。这也表明尽管同属乳腺癌细胞，但不同的细胞对