自然杀伤细胞(NK细胞)是机体内除T细胞和B细胞以外的另一类重要的淋巴细胞,是固有免疫系统的成员之一,参与机体抗感染和抗肿瘤应答,也具有免疫调节作用。与T细胞不同,NK细胞非特异性识别靶细胞,主要通过其表面的杀伤性免疫球蛋白样受体(KIR)与靶细胞的MHC-Ⅰ分子相互作用来区分“自我”和“非我”的细胞。NK细胞对表达自身MHC-Ⅰ分子的正常细胞不杀伤,对异常下调表达或不表达MHC-Ⅰ分子的靶细胞则启动杀伤机制。抑制性KIR与MHC-Ⅰ相互作用介导NK细胞“教育”,使其获得表型和功能成熟,但对于NK细胞发育过程中KIR的表达调控机制仍有待研究。另外,越来越多的临床相关研究表明,除抑制性KIR外,活化性KIR受体也可能影响NK细胞功能发挥。一、KIR表达调控与NK细胞成熟人外周血NK细胞中,KIR受体主要表达于CD56dimCD16+NK细胞,而CD56briCD16low-/-NK细胞几乎不表达KIR受体(除KIR2DL4外)。通常认为,在NK细胞开始发育成熟的阶段,KIR以随机的模式表达在NK细胞上,且认为KIR分子启动子区的甲基化与NK细胞特定KIR谱的维持相关。目前为止,涉及KIR表达调控相关因子的报道还很少,KIR表达调控的具体机制仍未明确。由于KIR分子对NK细胞功能的重要性,研究KIR表达调控元件有利于加深我们对临床中与KIR/MHC相关疾病及NK细胞应用的认识。我们的研究围绕NK细胞KIR分子的表达调控相关因子展开。外周血NK细胞主要由骨髓CD34+造血前体细胞发育而来。分离新生儿脐带血中的CD34+造血干细胞,在体外用多种细胞因子刺激培养,且无需饲养细胞支持,就可以诱导其向NK细胞的表型分化。我们发现这种体外分化体系得到的成熟NK细胞其KIR表达比例远低于外周血NK细胞。我们通过流式分选得到外周血KIR+CD56dimCD16+,KIR-CD56dimCD16+和CD56briCD16-三种类型的NK细胞,以及KIR+和KIR-体外分化NK细胞,并对以上5种细胞进行转录组的RNA测序。通过对以上5组NK细胞的比较分析,我们发现体外诱导NK细胞虽然具有外周血成熟NK细胞部分特征性表型,如CD56、CD16、CD107a、perforin等,但其全转录组基因的表达谱区别于外周血NK细胞。另外,体外诱导NK细胞与外周血CD56briCD16-NK细胞的转录组基因的表达谱更为接近,而其自身KIR-与KIR+细胞在转录谱上差异度较小。通过生物信息学手段分析外周血KIR+和KIR-(KIR-包括KIR-CD56dimCD16+和CD56briCD16-)NK细胞的差异基因及体外诱导分化的NK细胞中KIR-和KIR+NK细胞的差异基因,我们发现在筛选到的差异基因中除KIR家族基因外,RASSF4基因在KIR+NK细胞中亦表达上调,而RUNX2、MYC、ID3基因在KIR+NK细胞中显著下调。另外,RUNX2基因在外周血CD56briCD16-NK细胞中的表达居外周血三组NK细胞中最高。我们还进一步研究了 NK细胞发育过程中RASSF4和RUNX2基因的表达。在人脐带血CD34+造血干细胞于人源化小鼠体内发育(辅以IL-15/IL-15Rα复合物RLI)的模型中,RASSF4基因在NK细胞发育的中期阶段表达升高,此后一直维持这种较高水平的表达,且发育成熟后也不下调;而RUNX2基因在NK细胞发育的中期阶段表达升高,但是在后期开始下降,成熟后表达水平较低。该现象提示NK细胞在体发育过程中,RASSF4可能促进NK细胞KIR的表达,而RUNX2可能与NK细胞KIR的表达沉默相关。人脐带血CD34+NK细胞体外分化体系展现了有不同的表达模式,RASSF4在NK细胞发育后期表达下调,而RUNX2则表达升高,这种差异可能与体外分化NK细胞低表达KIR分子相关。我们的研究发现了两个关键的分子RASSF4、RUNX2,它们与NK细胞KIR的表达相关,可能参与KIR表达调控,其具体机制还需要进一步的探讨。二.活化性KIR3DS1参与HBV免疫应答NK细胞是固有免疫系统的重要组成部分,在机体早期抵御外部感染中发挥重要作用。KIR是NK细胞识别被感染细胞的重要受体,其具有高度的等位基因多态性。已经有很多研究表明,KIR及其配体HLA的基因多态性与多种感染性疾病如HIV,HCV的感染或疾病进程存在相关性。但是KIR及其配体HLA与乙型肝炎(HBV)治疗效果的相关性还鲜有研究。我们通过对CHB(慢性乙型肝炎)病人临床治疗的观察,探讨KIR/HLA基因型与乙肝的感染及α干扰素治疗CHB病人的治疗效果的相关性,并寻找对CHB病人治疗效果有提示作用的KIR/HLA基因型。为此,我们选取了临床实验中119例接受α干扰素单独治疗或核苷类似物联合α干扰素治疗的e抗原阳性的CHB病人作为研究对象,另外选取96例体检正常的健康人作为对照,对其所有KIR基因及三种主要HLA配体(HLA-C1,HLA-C2,HLA-Bw4)的基因型进行了PCR-SSP分型鉴定。在接受了为期48周的治疗和24周的后续随访观察后,共有43例病人获得了持续性应答(表现为e抗原转阴,HBVDNA拷贝数低于2,000IU/mL及转氨酶水平恢复正常)而其余76例病人表现为对治疗不应答。我们研究了慢性乙型肝炎病人与健康人群,接受抗病毒治疗后获得持续性应答的病人与不应答病人的KIR及HLA的基因分型,携带情况,结合乙肝病人动态监测的病毒学和血清学指标,取得了以下结论:1.乙肝主要在亚洲地区流行,在欧洲和北美地区流行率较低。而HBV的感染和慢性疾病的形成是否与人群中KIR基因的携带或缺失相关仍需要进一步研究。为了研究KIR基因与HBV感染是否相关,我们分析了 96例体检正常的健康人与119例CHB病人KIR基因的携带情况,没有显著性的差异。但是与文献中已经报道的高加索人群中KIR基因的携带率进行对比后,发现汉族人群,特别是汉族的CHB人群,其活化性KIR的携带率显著低于高加索人群。因此,活化性KIR可能与HBV感染的自然清除相关。2.干扰素疗法可以促进免疫系统抗原递呈,活化NK细胞及其它免疫细胞,从而促进HBV的清除。KIR是否在此过程中对NK细胞的活化状态起着一定的调节作用?为此,我们对经48周干扰素单独治疗或联合核苷类似物治疗的CHB病人进行研究,发现KIR3DS1在表型为对治疗持续性应答的病人群体有更高的携带率(51.2%v.s.18.4%,[OR]= 4.64,P=0.0002)。而 KIR3DS1 又是 NK细胞的活化性受体,该现象提示我们KIR3DS1可能促进了 NK细胞的抗病毒功能。3.KIR分子的功能发挥离不开与其配体HLA分子的相互作用。我们对KIR及其可能配体的基因型组合的携带率进行分析后发现同时拥有KIR3DS1与HLA-B Bw4Ile基因的CHB病人有更好的治疗效果,在治疗过程中,HBV DNA、HBeAg的水平下降更为显著。4.多项逻辑回归模型可以用于预测干扰素治疗CHB的治疗效果的指标,该模型的结果表明KIR3DS1/HLA-B Bw4Ile基因型组合在CHB的治疗过程当中具有正向保护作用,可以作为预测病人获得更高治疗应答率的指标(OR= 16.98,P =0.01)。综上所述,我们的研究主要集中于NK细胞重要受体KIR的获得和功能。我们首先研究了 KIR受体,特别是抑制性KIR受体,在外周血NK细胞和脐带血来源CD34+造血干细胞体外分化得到的NK细胞的表达。进一步通过生物信息学手段分析与KIR表达获得和维持相关的表达调控元件,发现RASSF4能正向作用于KIR的表达,而转录因子RUNX2 可能参与KIR表达的负向调控。但具体机制还有待进一步探讨。另外,通过对慢性乙型肝炎临床治疗的观察,我们发现活化性KIR基因与HBV感染和流行相关,并首次发现活化性KIR3DS1及其可能的配体HLA-B Bw4-80Ile基因型组合与慢性乙型肝炎病人对干扰素治疗产生持续性应答相关。该基因型组合可以作为治疗效果的预测指标。同时,本研究提高了我们对活化性KIR参与NK细胞抗HBV免疫应答的认识。