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一、背景与目的 唇腭裂是最常见的先天性畸形之一,它对患者、家庭以及社会都带来了沉重的创伤,目前唇腭裂的发病机制尚未明确。基于本课题组前期通过microRNA芯片技术,我们筛选出实验组和对照组间有显著差异的microRNA,并通过数据库预测出其潜在靶基因。本实验旨在通过对miRNA-106a-5p和其下游靶基因Tgfbr2的研究,探索miRNA-106a-5p在腭裂发生过程中的作用机制。 二、方法 1、建立维甲酸诱导腭裂模型:将24只怀孕KM小鼠随机分为实验组和对照组,每各组12只。在胚胎发育10.5天,实验组小鼠以70mg/kg剂量的维甲酸灌胃,对照组小鼠使用植物油灌胃; 2、在胚胎发育13.5天、14.5天、15.5天、16.5天处死小鼠,观察胚鼠腭部大体形态,统计腭裂发生率,并提取腭突组织,保存在-80℃冰箱以用于后续实验; 3、运用RT-qPCR技术检测miRNA-106a-5p、Tgfbr2在实验组和对照组的表达水平; 4、运用双荧光素酶实验验证Tgfbr2为miRNA-106a-5p下游靶基因; 5、提取胚胎发育13.5天小鼠腭突组织,进行腭突间充质细胞培养,运用lipo 2000向细胞内转染miRNA mimic和miRNA-NC,培养24小时后,检测细胞形态学变化; 6、运用Western blot技术检测TGF-Beta信号通路相关蛋白表达水平。 三、结果 1、RT-qPCR结果显示实验组miRNA-106a-5p表达水平明显较对照组上调(P<0.05),而Tgfbr2在实验组的表达水平较对照组明显下调(P<0.05); 2、双荧光素酶报告系统检测结果显示:突变型(Tgfbr2-Mut)+miR-106a-5p mimic共转染组的荧光素酶活性相对NC组无明显变化(p>0.05),野生型(Tgfbr2-WT)+miRNA-106a-5p共转染组的荧光素酶素酶活性相对阴性对照组组显著降低(p<0.05),因此我们认为miRNA-106a-5p可以调控Tgfbr2的表达; 3、向腭突间充质细胞中转染miRNA-106a-5p mimic,miRNA-NC,培养24小时后,流式细胞术检测细胞凋亡情况,发现转染miRNA-106a-5p mimic组的腭突间充质细胞凋亡明显增加(P<0.05); 4、Western blot结果显示,TGFBR2,以及磷酸化的SMAD2/3蛋白水平降低。 四、结论 1、miRNA-106a-5p表达上调导致腭突间充质细胞凋亡率增加,导致腭裂的发生; 2、miRNA-106a-5p可能通过调控TGF-Beta信号通路导致了腭裂的发生。