研究背景：溺水是一个非常危险的公共伤害事件，但是却常常被人们忽略。它是仅次于道路交通事故的第二大意外伤害的原因，尤其在青少年群体当中更为突出。水经口鼻吸入到肺，可以破坏肺泡上皮的屏障功能，导致肺水肿及炎症反应，进而急性肺损伤（acute lung injury，ALI），严重时还可以进展成为急性呼吸窘迫综合征（acuterespiratory distress syndrome，ARDS）。先前的研究已经表明，海水吸入引起肺损伤主要是由于高渗的刺激引起核转录因子κB （NF-κB）的磷酸化激活和炎症因子的释放。然而NF-κB在海水吸入型肺损伤（seawater inhalation induced acute lung injury,SWI-ALI）中的作用机制并未完全阐明。STE20相关脯氨酸丙氨酸丰富的蛋白激酶（Ste20-like proline-/alanine-rich kinase,SPAK）属于STE20激酶家族中的重要成员。 SPAK广泛表达在许多物种和多种器官、组织中。SPAK的最主要功能是磷酸化和激活Na+-K+-2CL-协同转运蛋白（Na-K-Cl cotransporter，NKCC）。NKCC是一个重要的离子转运蛋白，介导了许多病理条件下的炎症反应。除此之外，SPAK在细胞增殖和分化，以及肠道炎症的调控方面也展现出了重要的作用。在很多实验中已经证明，SPAK可以激活p38通路，表明其在介导高渗引起的炎症反应方面起着至关重要的作用。研究表明，在高渗诱导小鼠结肠炎性肠病模型中，SPAK的过高表达可以加剧小鼠的结肠炎的程度，其原因可能与SPAK的过高表达引起了肠壁上皮细胞屏障功能的障碍以及肠壁细胞炎性细胞因子释放的增加有关。据此，我们推测，SPAK可能以类似的机制也参与到了海水吸入型肺损伤时炎症反应的调节。实验目的：1．通过复制海水吸入型肺损伤模型，观察海水吸入后肺组织SPAK表达的变化。2．研究引起SPAK表达变化的调节通路，明确其上游的调节分子。3．通过siRNA技术干扰SPAK的表达，研究SPAK在海水刺激时所起到的作用及其病理生理机制。实验方法：实验一：健康的雄性SD大鼠共30只，根据电脑产生的随机数，将其排序并分为5组，分别为：正常组（N）、海水吸入1小时组（1H）、海水吸入3小时组（3H）、海水吸入6小时组（6H）、海水吸入12小时组（12H）。每组各有大鼠6只。从大鼠的颈部正中间突出部分切口，分开气管前的甲状腺和肌肉组织以暴露气管，经气管向肺内缓慢地注入预先配制好的海水。剂量为4ml/kg，时间为4min。观察注入海水后大鼠的表现，出现呼吸急促，经口鼻溢出粉红色的泡沫样分泌物，初步确认动物模型建立成功。在海水吸入后的1h、3h、6h、12h分别将大鼠放血处死，并收集、保存相关的标本。正常组的大鼠不注入海水，其余处理与实验组相同。（1）将各组的大鼠放血处死后所获得的右下肺脏标本用纱布轻轻擦干，然后置于分析天平上进行称重，即获得肺组织的湿重。烘干后称重并记录肺组织的干重，计算得到肺的湿干比。肺组织的湿干比反映了肺脏水肿的严重程度。（2）将组织块切成5μm厚的组织切片，进行H-E染色，观察肺组织的结构变化。（3）通过ELISA方法检测各组大鼠肺组织匀浆中TNF-α及IL-1β含量的变化。（4）选用免疫组织化学染色的方法观察各组大鼠肺组织中SPAK蛋白的表达情况，包括表达的部位和表达的程度。（6）通过蛋白质印迹方法检测海水吸入后肺组织中SPAK表达的改变。（7）通过RT-PCR方法检测SPAK转录水平的改变。实验二：本部分为细胞实验，实验中所选择的细胞为大鼠肺泡巨噬细胞：即NR8383细胞。按时更换培养基传代，保证细胞处于对数生长期进行扩增。实验前24小时将细胞离心分离，然后更换无血清培养基。将细胞分成三组：正常组、海水处理组和PDTC预处理+海水组。各组的处理为：正常组不做特殊的处理，海水处理组将培养基更换为含有25%配方海水的培养基，PDTC预处理组在更换含有25%配方海水的培养基前30分钟给予PDTC（200μM）预处理。其余处理同海水处理组。4小时后离心收集上清液和细胞。（1）通过Western blot方法测定PDTC预处理对海水引起的SPAK表达变化有无抑制作用。（2）通过siRNA干扰SPAK的表达，然后测定细胞上清液中TNF-α及IL-1β含量的改变，从而反映SPAK在炎症反应调节方面的作用。实验结果：实验一：1．吸入海水后肺组织的湿干比与正常情况下相比明显增大（P<0.001），显示海水吸入可以造成肺部明显的水肿。2．HE染色结果显示吸入海水后肺脏肉眼可见体积膨胀、增大，呈血红色，表面散布出血点；光镜下观察可见肺泡壁增厚，有明显的水肿迹象，肺泡腔内可见炎性渗出，肺泡结构遭到破坏。3．吸入海水后肺内细胞分泌炎症因子TNF-α、IL-1β与正常情况对比有明显的增多（P<0.05），且随着时间而不断累积，在6小时左右达到最大值。4．免疫组化染色结果显示与正常组相比，海水吸入组中代表SPAK表达的深棕染的细胞明显增多，且在细胞浆和细胞核均有分布，表明吸入海水后在细胞核和细胞浆中SPAK表达明显升高。5．Western blot结果显示吸入海水后肺组织受海水刺激的影响，SPAK蛋白表达明显增加，最高可达对照组的2.7倍左右。6．PCR结果显示实验组SPAK转录较正常情况明显升高，在3小时左右达到顶峰，约为正常水平的3.2倍左右。实验二：1．海水刺激可以明显增加NR8383细胞中磷酸化NF-κB占总NF-κB的比值，而NF-κB的抑制剂PDTC的预处理可以明显抑制这一反应。PDTC的预处理同样可以抑制海水刺激引起细胞中SPAK的转录及翻译水平的升高。2．海水的刺激可以明显的增加细胞炎症因子TNF-α、IL-1β的释放，而在SPAK表达下调的细胞中，海水刺激虽然也可以引起炎症因子释放的增加，但与未干扰组相比，释放量明显减少，表明炎症反应受到了一定程度的抑制。结论：本实验通过重复和观察大鼠海水吸入型肺损伤模型，表明在海水高渗透压的刺激下，细胞通过转录和翻译上调SPAK的表达，参与了肺的炎症反应，加重了急性肺损伤的程度。并且通过抑制上游NF-κB的激活，对SPAK的转录和翻译过程起到了调控的作用。在体外实验中，我们发现下调NR8383细胞中SPAK的表达，可以显著抑制了海水吸入所导致的炎症因子释放。