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目的:研究髓源性抑制细胞(MDSC)介导慢性间歇低氧(CIH)对肺癌易感性的作用及其机制。方法:(1)收集苏州大学附属第一医院阻塞性睡眠呼吸暂停综合征(OSAS)患者和年龄对应的健康人(对照)外周血标本;建立C57BL/6J CIH小鼠模型,收集CIH小鼠和正常小鼠(对照)的尾静脉血和脾脏标本,并流式细胞仪检测OSAS患者、健康人外周血中CD14+HLA-DR-/low MDSC的数量及CIH小鼠、正常小鼠外周血、脾脏中CD11b+Gr1+MDSC 的数量。(2)流式细胞仪分选OSAS患者、健康人外周血中的CD14+HLA-DR-/lowMDSC;磁珠阴性选择法分选OSAS患者、健康人外周血中的T细胞;磁珠阳性选择法分选CIH小鼠、正常小鼠脾脏中的CD11b+Gr1+MDSC;尼龙毛柱法纯化CIH小鼠、正常小鼠脾脏中的T细胞,并磁珠阴性选择法纯化CD4+T、CD8+T细胞。(3)采用CFSE标记的OSAS患者、健康人外周血中的T细胞与自体来源的CD14+HLA-DR-/lowMDSC共培养;CFSE标记的CIH小鼠、正常小鼠脾脏中的T、CD4+T、CD8+T细胞与自体来源的CD11b+Gr1+MDSC共培养;CFSE标记的正常小鼠脾脏中的T、CD4+T、CD8+T细胞分别与CIH小鼠、正常小鼠脾脏中CD11b+Gr1+MDSC共培养进行体外T细胞增殖实验。(4)C57BL/6J小鼠骨髓来源树突状细胞(BM-DC)诱导培养、成熟,并鸡卵白蛋白(OVA)抗原负载,制备DCOVA。DCOVA免疫CIH小鼠、正常小鼠;DCOVA+CIH小鼠脾脏MDSC、DCOVA+正常小鼠脾脏MDSC免疫正常小鼠;DCOVA免疫Gr1阻断型抗体处理的CIH小鼠(MDSC-)、同型对照抗体处理的CIH小鼠(MDSC+)。免疫6天后,Tetramer法流式细胞仪检测小鼠外周血中的OVA特异性CD8+CTL。(5)CFSE高浓度(H-2Kb限制性OVAI抗原肽负载,用作靶细胞)、CFSE低浓度(不相关H-2Kb限制性Mut1抗原肽负载,用作阴性对照靶细胞)标记的C57BL/6J小鼠脾细胞尾静脉注射于DCOVA免疫6天后的CIH小鼠、正常小鼠;DCOVA+CIH小鼠脾脏MDSC、DCOVA+正常小鼠脾脏MDSC免疫6天后的正常小鼠,流式细胞仪分析体内OVA特异性CD8+CTL介导的杀伤效应。(6)构建表达OVA的pcDNA3.1+真核表达质粒(pcDNA3.1+/OVA),将其转染LLC小鼠肺癌细胞后,通过新霉素加压筛选并抗性克隆单克隆培养,并RT-PCR、流式细胞仪、Western blot鉴定OVA的表达,建立OVA高表达的转基因LLC-OVA小鼠肺癌细胞(用作OVA特异性肿瘤靶细胞)。将LLC-OVA皮下接种DCOVA免疫6天后的CIH小鼠、正常小鼠;DCOVA+CIH小鼠脾脏MDSC、DCOVA+正常小鼠脾脏MDSC免疫6天后的正常小鼠,监控肿瘤的生长。(7)ELISA、流式细胞仪、qRT-PCR/Western blot分别检测OSAS患者、健康人外周血CD14+HLA-DR-/low MDSC及CIH小鼠、正常小鼠脾脏CD11b+Gr1+MDSC中IL-6、TNFα、IL-10、TGFβ1细胞因子的分泌;PD-L1膜分子的表达;及Arg1、iNOS、HIF1α的表达。(8)Gr1阻断型抗体处理的CIH小鼠(MDSC-)、同型对照抗体处理的CIH小鼠(MDSC+)、Gr1阻断型抗体处理的的正常小鼠(MDSC-)、同型对照抗体处理的正常小鼠(MDSC+)皮下接种LLC小鼠肺癌细胞,分析CIH(OSAS)条件下的MDSC在促进肿瘤成瘤以及生长中的作用。结果:第一部分OSAS(CIH)条件对MDSC数量的影响OSAS患者、CIH小鼠中MDSC数量增加与健康人比较,OSAS患者外周血中CD14+HLA-DR-/low MDSC的数量明显增多(p<0.05);与正常小鼠比较,CIH小鼠外周血、脾脏中CD11b+Gr1+MDSC的数量也均明显升高(p<0.05)。第二部分OSAS(CIH)条件下的MDSC对T细胞免疫功能的影响(1)OSAS患者、CIH小鼠的MDSC具有更强的体外抑制T细胞增殖的能力OSAS 患者的 CD14+HLA-DR-/low MDSC 较健康人的 CD14+HLA-DR-/low MDSC,具有更强的体外抑制自体T细胞增殖的能力(p<0.05);CIH小鼠的CD11b+Gr1+MDSC较正常小鼠的CD11b+Gr1+MDSC,也具有更强的体外抑制自体、异体(正常小鼠)T、CD4+T、CD8+T细胞增殖的能力(p<0.05)。(2)CIH小鼠的MDSC具有更强的抑制DCOVA体内刺激OVA特异性CD8+CTL反应的能力与DCOVA免疫的正常小鼠比较,DCOVA免疫的CIH小鼠外周血中FITC-CD8+PE-Tetramer+双阳性T细胞的数量明显减少,呈现了较弱的OVA特异性CD8+CTL反应(p<0.05);与DCOVA+正常小鼠脾脏MDSC免疫的正常小鼠比较,DCOVA+CIH小鼠脾脏MDSC免疫的正常小鼠也呈现了更弱的OVA特异性CD8+CTL反应(p<0.05)。(3)剔除MDSC很大程度上恢复了 DCOVA刺激OVA特异性CD8+CTL反应的能力在CIH小鼠中,预去除MDSC能够很大程度上恢复了 DCOVA刺激OVA特异性CD8+CTL反应的能力(p<0.05)。CIH条件下的MDSC在介导抑制DCOVA刺激OVA特异性CD8+CTL反应中扮演着重要角色。(4)CIH小鼠的MDSC具有更强的抑制DCOVA刺激OVA特异性CD8+CTL杀伤活性的能力与DCOVA免疫的正常小鼠比较,DCOVA免疫在CIH小鼠中刺激的OVA特异性CD8+CTL呈现了较弱的OVA特异性靶细胞杀伤活性(p<0.05);与DCOVA+正常小鼠脾脏MDSC免疫的正常小鼠比较,DCOVA+CIH小鼠脾脏MDSC免疫在正常小鼠中刺激的OVA特异性CD8+CTL也呈现了更弱的OVA特异性靶细胞杀伤活性(p<0.05)。CIH小鼠的MDSC更强的抑制了具有杀伤活性的OVA特异性效应CTL的产生。(5)CIH小鼠的MDSC具有更强的抑制DCOVA刺激OVA特异性CD8+CTL介导的预防性抗肿瘤免疫的能力与DCOVA免疫的正常小鼠比较,DCOVA免疫在CIH小鼠中刺激的OVA特异性CD8+CTL呈现了较弱的预防性抗肿瘤免疫潜能(p<0.05);与DCOVA+正常小鼠脾脏MDSC免疫的正常小鼠比较,DCOVA+CIH小鼠脾脏MDSC免疫在正常小鼠中刺激的OVA特异性CD8+CTL也呈现了更弱的预防性抗肿瘤免疫潜能(p<0.05)。第三部分OSAS(CIH)条件下的MDSC增强免疫抑制功能的机制研究(1)OSAS患者、CIH小鼠的MDSC分泌了更高水平的IL-6、TNFα、IL-10、TGFβ1OSAS 患者的 CD14+HLA-DR-/low MDSC 较健康人的 CD14+HLA-DR-/low MDSC;CIH小鼠的CD11b+Gr1+MDSC较正常小鼠的CD11b+Gr1+MDSC,均分泌了更高水平的 IL-6、TNFα、IL-10、TGFβ1 细胞因子(p<0.05)。(2)OSAS患者、CIH小鼠的MDSC表达了更高水平的PD-L1OSAS 患者的 CD14+HLA-DR-/low MDSC 较健康人的 CD14+HLA-DR-/low MDSC;CIH小鼠的CD11b+Gr1+MDSC较正常小鼠的CD11b+Gr1+MDSC,均表达了更高水平的PD-L1免疫负性共刺激分子(p<0.05)。(3)OSAS患者、CIH小鼠的MDSC表达了更高水平的Arg1、iNOS、HIF1αOSAS 患者的 CD14+HLA-DR-/low MDSC 较健康人的 CD14+HLA-DR-/low MDSC;CIH小鼠的CD11b+Gr1+MDSC较正常小鼠的CD11b+Gr1+MDSC,均表达了更高水平的Arg1、iNOS代谢酶和HIF1α关键信号分子(p<0.05)。第四部分OSAS(CIH)条件下的MDSC在介导肺癌易感性中的作用研究CIH小鼠肺癌易感性增加,OSAS(CIH)条件下的MDSC在介导肺癌易感中起重要作用与正常小鼠比较,CIH小鼠接种LLC小鼠肺癌细胞后更易成瘤,增加了肿瘤易感性(p<0.05)。并且在成瘤的小鼠中发现,CIH小鼠较正常小鼠肿瘤生长明显加速(p<0.05)。剔除MDSC能够削弱LLC肿瘤细胞在CIH小鼠中的致瘤性(p<0.05)。结论:OSAS(CIH)可能通过活化HIF1α信号诱导MDSC数量增加、免疫抑制相关分子表达升高,进而增强MDSC的免疫抑制能力。MDSC在介导CIH易感肺癌过程中扮演了重要角色。