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第一部分 大脑Willis环穿破法建立大鼠蛛网膜下腔出血模型 蛛网膜下腔出血(SAH)是最常见的脑血管意外之一,脑血管痉挛(CVS)是其最严重的并发症。迄今为止,尚缺少一种十分理想的SAH动物实验模型。我们在文献报道的基础上,加以改进,采用大脑Willis环穿破法,制作了一种稳定可靠且不需开颅的大鼠SAH模型。 1、材料与方法 (1) 动物:SD雄性大鼠30只,体重300g～350g。随机将大鼠分为SAH组和假手术组,每组各15只。 (2) 模型制备:大鼠麻醉后,暴露右侧的颈总动脉主干,颈外动脉及颈内动脉。从颈外动脉插入3一0单丝尼龙线,当尼龙线头部距颈总动脉分叉约18一19mm时,感到阻力,表明尼龙线头部已到达大脑中动脉与大脑前动脉分叉处,略用力再伸入尼龙线Zmm,此时尼龙线头部已经穿破大脑中、前动脉分叉处。然后完全退出尼龙线,结扎颈外动脉,缝合颈部皮肤。假手术组仅插入尼龙线,而未穿破大脑中、前动脉分叉处。 (3)颅底解剖学检查:大鼠SAH造模后2小时和48小时,完整取出脑组织,观察SAH的程度和范围。 (4)脑水含量测定:大鼠SAH造模后48小时,取脑,称重(湿重),然后将脑组织放于烘箱105℃24小时,再称重(干重)。脑水肿程度以如下公式表示:(湿重一干重)/湿重xl0o%。 (5)基底动脉直径测定:大鼠SAH造模后48小时,用印度墨水浇铸基底动脉后测定其直径。 2、结果 (1)颅底解剖学检查:SAH造模后2小时有明显的出血,血块分布很广,累及整个Wiilis环;SAH造模后48小时,出血明显吸收,可见少数陈旧性血块附着在Willis环周围。假手术组无明显的SAH形成。 (2)基底动脉直径测量:造模后48小时,SAH组基底动脉直径(195士42娜)明显小于假手术组(28肚54脚,p<0.01),提示SAH组基底动脉明显出现痉挛。 (3)脑水含量检测:造模后48小时,SAH组的脑组织水含量(80.6切.8%)明显高于假手术组(79.1士0.7%,p<0.05),提示SAH组的脑组织出现明显脑水肿。3、结论采用大脑Wiliis环穿破法能成功建立大鼠SAH模型。第二部分蛛网膜下腔出血后脑血管NADPH氧化酶来源的 超氧阴离子水平的变化研究 SAll后,脑血管产生大量氧自由基,尤其是超氧阴离子。文献报道转染外源性超氧化物歧化酶基因可明显改善CVS,超氧化物歧化酶转基因小鼠,SAH后CVS明显减轻,提示超氧阴离子在SAH后CVS的发生机制中起着重要的作用。超氧阴离子有多种来源,尤以NADPH氧化酶为主。在许多血管性疾病的发生发展中,NADPH氧化酶来源的超氧阴离子起着重要的作用。Racl是NADPH氧化酶的重要亚单位,是其活性的调控开关。本文旨在研究NADPH氧化酶及Racl在SAH后CvS发生中的作用机制。 1、材料和方法 (l)动物:sD雄性大鼠30只,体重3009一3509。将大鼠随机分为SAH组和假手术组,每组各15只。 (2)大鼠SAH模型的建立,具体见第一部分。 (3)Racl活性检测采用Westem Blot法,严格按说明书操作。 (4)NADPH氧化酶活性测定 将基底动脉在匀浆器中研磨后,4℃5000印m离心20分钟,吸取上清液,并测定蛋白浓度(mg/ml)。将10林l上清液及10林l的lucige垃n加入980林l的E淦ebs液,暗适应10分钟后每30秒计数一次,共10次,读取平均值,并按以下公式计算NADPH氧化酶活性:读数平均值X2/蛋白浓度。其单位为RLU/分钟/m 9 Protein,RLU=Relative Lisht Unito (5)超氧阴离子原位测定取附有脑基底动脉的脑干,横切成上部、中部、下部,放入OCT胶中于一80℃冻存5分钟后冰冻切片,切片晾干半小时后,加入HZDCFDA37℃孵育半小时,以PBS(PH7.4)洗三次后加盖载玻片,在荧光显微镜观察荧光强度,激发光波长为48OIun,发射光波长为530nm。 2、结果 采用大脑Willis环穿破法建立大鼠SAH模型后48小时,比较SAH组和假手术组,发现: (l) SAH组基底动脉Racl活性(9肚18%)明显高于假手术组(52士11%,P<0 .05)。 (2)SAH组基底动脉NADPH氧化酶活性(29.肚6.7RLU/m1可mg protein)明显高于假手术组(15.8士4.6 RLU/mi可mg protein,p<0.05)。 (3)SAH组基底动脉超氧阴离子水平(10.25月.05RLU)明显高于假手术组(5 .43士0.98 RLU,P<0.05)。3、结论NADPH氧化酶参与了SAH后CVS的发生。这可能与Racl活化,NADPH氧化酶被激活,从而产生超氧阴离子,导致脑血管收缩有关。第三部分重组腺病毒介导的突变型Racl基因治疗蛛网膜下腔出血 后脑血管痉挛的实验研究 NADPH氧化酶来源的超氧阴离子在SAH后CVS的发生机制中起着重要的作用。Racl是调控NADPH氧化酶活性的亚单位。上述研究表明脑血管Racl及NADPH氧化酶活性在SAH后明显增加,提示Racl活化可激活NADPH氧化酶。由于突变型Racl基因表达的无活性Racl蛋白可以阻断Racl活化,本文将重组腺病毒介导的突变型Racl基因(AdN 17Racl)转染脑基底动脉,观察SAH后CVS的变化,探讨突变型Racl基因治疗的可能疗效。1、材料和方法(l)动物:sD雄性大鼠40只,体重300一35鲍。将大鼠随机分为对照组(腺病毒携带报告基因,AdLacZ)和基因治疗组(AdN17Racl),每组各20只。 (2)基因转染 大鼠麻醉后,取俯卧位,四肢固定,后颈部剃毛,切开后颈肌群,暴露环枕筋膜,用微量进样器将10卯l携带LacZ或N17Racl的腺病毒(?