目的:多发性硬化(multiple sclerosis, MS)是一种主要由T细胞介导,以中枢神经系统白质脱髓鞘病变为特点的自身免疫性疾病。实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)是MS的经典动物模型。目前病因及发病机制尚未明确。大量的研究表明MS和EAE的发生与T细胞的异常活化有关,发现CD4+T细胞在MS的发病机理中处于核心地位。既往比较认可的机制为Th1/Th2失衡导致MS。Th1通过分泌IL-2、IL-12、IFN-γ等因子,加重MS病情;Th2通过分泌IL-4、IL-5、IL-10等因子,缓解病情。新近又提出Th17/Treg失衡导致MS,Th17通过分泌IL-17加重炎症,调节性T细胞(regulatoryT cell, Treg)可抑制免疫反应,减轻炎症。对免疫耐受机制及其诱导方法的研究,已成为目前MS免疫研究的重点之一。树突状细胞(dendritic cell, DC)是迄今为止惟一能刺激初始T细胞活化、增殖的抗原提呈细胞(antigen presenting cell, APC)。DC是特异性免疫应答的启动者,在MS的病理免疫应答中起关键作用。近来研究发现DC在免疫调节中发挥免疫应答和免疫耐受的双重作用,故而提出了耐受性DC( tolerogenic dendritic cell, tDC)的概念。即DC向T细胞提呈抗原可有两种不同结果:免疫刺激(免疫原性)或免疫抑制(耐受原性)。根据成熟程度,将DC分为未成熟DC ( immature DC, imDC)和成熟DC (mature DC, mDC)。两种DC形态、细胞表型和功能不同。DC可通过细胞表面分子和分泌细胞因子的改变,调节抗原特异性T细胞分化,引起不同的免疫应答。不同类型的DC具有不同的特征,imDC能诱导免疫耐受,mDC有很强的抗原提呈能力,能够激发初始T细胞的活化。基因修饰DC,诱导耐受性DC,从而治疗多发性硬化等自身免疫病,已成为目前研究的热点。Foxp3(forkhead/winged helix transcription factor )称为叉状头/翅膀状螺旋转录因子,是FOXP3+Tregs特异性转录因子,在调控Treg细胞的发育和功能上起重要作用。将FOXP3基因转染细胞,诱导产生有调节功能的细胞,为调节性细胞用于多发性硬化等自身免疫性疾病的临床免疫治疗提供了可能。吲哚胺-2,3双加氧酶(Indoleamine 2, 3-xygenase, IDO),是色氨酸分解代谢的限速酶,可在局部形成低色氨酸环境。DC表达IDO参与了机体的免疫耐受。DC表达IDO,通过色氨酸衰竭和毒性代谢产物来诱导T细胞无能,抑制T细胞增殖、促进凋亡。新近发现IDO还可以诱导产生Treg,进而介导免疫耐受。两者之间存在着相互促进的关系,即IDO可以诱导产生新的Treg,而Treg又可诱导IDO的表达。Treg可通过表面的细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic T-lymphocyte associated antigen-4, CTLA-4)与DC表面B7-1/B7-2结合,激发DC细胞IDO的高表达。本研究应用FOXP3基因过表达腺病毒转染imDC,观察转染后imDC(DC.FOXP3)的生物学特性、细胞表型及自身各种细胞因子的表达和分泌的变化。在体外观察DC.FOXP3对EAE模型小鼠脾脏CD4+T细胞的影响,并用IDO抑制剂1-甲基色氨酸(1-methyl tryptophan, 1-MT)拮抗IDO作用,从而探讨DC.FOXP3诱导免疫耐受的机制。为临床防治MS提供新的思路。方法:1小鼠FOXP3基因过表达重组腺病毒载体的构建和鉴定小鼠FOXP3基因为模板,PCR扩增目的基因,并将其克隆到腺病毒载体pAV-MCMV-GFP-3FLAG上,测序后腺病毒包装、纯化、鉴定,测病毒滴度。分别将构建的质粒和腺病毒转染293细胞,通过荧光显微镜检测表达,观察到GFP的表达,Western blot方法检测293细胞中FOXP3蛋白的表达。2小鼠FOXP3基因过表达腺病毒转染imDC及鉴定体外从小鼠骨髓分离、培养、磁珠纯化DC,并采用光镜、扫描电镜、透射电镜观察细胞形态,流式细胞技术(flow cytometry, FCM)鉴定CD11c、MHCII、CD80、CD86的表达水平,CCK-8法检测混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reaction, MLR)。FOXP3基因重组腺病毒转染小鼠骨髓源imDC后用倒置荧光显微镜观察绿色荧光,测定转染效率,分别用RT-PCR和western blot法,检测FOXP3基因转染imDC中FOXP3基因在mRNA及蛋白水平的表达。3 FOXP3基因过表达腺病毒转染对小鼠imDC生物学特性和表型的影响FOXP3基因重组腺病毒转染imDC后,采用扫描电镜和透射电镜观察转染后imDC的形态,FCM鉴定CD11c、MHCII、CD80、CD86的表达水平,用实时荧光定量PCR(RealtimePCR, QPCR)的方法检测了转染后imDC的mRNA基因水平各种细胞因子的表达。用ELISA的方法检测DC.FOXP3的细胞因子的分泌。4 FOXP3基因过表达腺病毒转染imDC诱导EAE小鼠CD4+T细胞免疫耐受的作用MOG35-55皮下注射小鼠构建EAE模型。病理切片观察小鼠脑部和脊髓的炎症变化。磁珠分离EAE小鼠脾脏CD4+T细胞与DC.FOXP3共培养。通过CD4+T细胞计数及CCK8法检测DC.FOXP3刺激CD4+T细胞增殖的能力。用AnnexinⅤ-7AAD检测DC.FOXP3对CD4+T凋亡的影响。DC.FOXP3组与CD4+CD25-T细胞共培养, FCM检测CD4~+CD25+FOXP3+Treg细胞数量占CD4+细胞数量的百分比。磁珠分选共培养体系中的CD4+T细胞,采用QPCR检测CD4+T细胞中各种细胞因子mRNA的表达。ELISA法检测上清中的细胞因子。应用IDO拮抗剂1-MT后观察CD4+T细胞数量,凋亡细胞数,CD4+CD25+FOXP3+Treg细胞数量的改变,CD4+T细胞中各种细胞因子mRNA的表达和上清中的细胞因子的改变。结果:1小鼠FOXP3基因过表达重组腺病毒载体的构建和鉴定PCR扩增FOXP3基因片段并将其克隆到腺病毒载体pAV-MCMV-GFP-3FLAG上,测序与Pubmed基因库FOXP3基因序列相符。重组腺病毒的包装、鉴定成功。测定腺病毒滴度为1.25X1011PFU/ml。通过荧光显微镜观察荧光强度高,观察到GFP的表达。Western Blot检测转染的293细胞,可观察到Foxp3-GFP-FLag融合蛋白阳性条带,基本判断FOXP3蛋白表达。2小鼠FOXP3基因过表达腺病毒转染imDC及鉴定①DC形态学改变:DC在光镜下观察,培养第5天的细胞有少量突起,集落数量增多。符合imDC形态。扫描电镜观察,imDC细胞形态呈圆形和类圆形,细胞表面皱褶多,突起少、短、细。mDC细胞形态多样,表面大量皱褶,有多量树枝状突起,粗细不均,较长。透射电镜观察,imDC细胞形态比较规则,表面突起短少,核多偏向一侧,胞浆内有较多吞饮泡及溶酶体,中等量的线粒体、内质网、核糖体。有的可见失去正常形态的“C”形溶酶体。mDC细胞形态不规则,表面有较长的突起,胞体较大,胞核不规则,胞浆内囊泡状结构、溶酶体减少,细胞器丰富,有多量线粒体,内质网、核糖体、高尔基体。②流式细胞仪检测DC细胞表面分子:磁珠分选imDC和mDC均高表达CD11c,纯度大于90%。imDC上细胞表面分子分别为MHCII(27.2%)、CD80(27.5%)、CD86(29.5%)呈低表达,mDC上分别为MHCII(99%)、CD80(98.8%)、CD86(98.4%)显著高表达。③MLR中DC对同种异基因T细胞的刺激增殖能力:imDC和mDC两组DC刺激T细胞增殖的能力均随DC所占比例增大而增强。相同反应比例imDC刺激T细胞的增殖能力,显著低于mDC,两组间差异均有统计学意义。④倒置荧光显微镜下观察:转染目的基因AD-FOXP3组imDC(DC.FOXP3)和转染空病毒AD-GFP组imDC(DC.GFP)均可见绿色荧光,未转染组imDC(DCN)未见荧光,表明FOXP3基因过表达腺病毒转染成功,转染率大于90%。⑤RT-PCR可检测到DC.FOXP3中FOXP3 mRNA的表达,Western Blot可检测到DC.FOXP3中FOXP3蛋白的表达。而DC.GFP和DCN中不能检测到FOXP3 mRNA和蛋白表达。3 FOXP3基因过表达腺病毒转染对小鼠imDC生物学特性和表型的影响①扫描电镜和透射电镜观察DC.FOXP3和DC.GFP与DCN相比,维持了imDC的未成熟表现。②FCM检测细胞表型:AD-FOXP3转染对imDC表面CD11c、MHC-II、CD80、CD86等分子的表达无影响,仍以未成熟型为主。③QPCR检测结果显示:在mRNA水平上,与DCN和DC.GFP比较,DC.FOXP3上FOXP3明显高表达,而对照组无表达。DC.FOXP3的Th1类细胞因子IFN-γ和Th17类细胞因子IL23、IL17表达明显减低,而Th2类细胞因子IL-10和IDO表达明显增高。④ELISA检测结果显示,与对照组相比,DC.FOXP3培养液上清中Th1类细胞因子: IFN-γ和Th17类细胞因子IL17分泌明显减低,而Th2类细胞因子IL-10分泌增高。4 FOXP3基因过表达腺病毒转染imDC诱导EAE小鼠脾脏CD4+T细胞免疫耐受的作用①本部分实验成功建立了小鼠EAE模型。光镜下病理切片观察HE染色示EAE组小鼠的大脑、颈、腰段脊髓有大量炎性细胞浸润，血管周围呈袖套样改变，主要分布在脑室周围及脊髓腰膨大区域的白质部分，并伴有脊膜增厚。对照组小鼠大脑和脊髓未见异常。②imDC与EAE小鼠CD4+T细胞共培养，与DCN和DC.GFP比较，DC.FOXP3能抑制EAE小鼠脾脏CD4+T细胞增殖，表现为CD4+T细胞数量减少和CCK-8检测DC.FOXP3刺激CD4+T增殖的能力减低。AnnexinⅤ-7AAD检测结果显示DC.FOXP3促进CD4+T细胞凋亡。③imDC与CD4+CD25-T细胞共培养,FCM检测DC.FOXP3能诱导CD4+CD25-T细胞向CD4+CD25+FOXP3+Treg的转化。④QPCR检测共培养体系中的CD4+T细胞中各种细胞因子的mRNA的表达，结果显示：DC.FOXP3抑制Th1细胞的转录子T-bet及细胞因子IFN-r和Th17细胞的转录子RORγt和细胞因子IL-17及促进IL-17分泌的IL-23的mRNA表达；上调Th2细胞的转录子GATA-3及细胞因子IL-4和Treg细胞的转录子FOXP3及细胞因子CTLA-4的mRNA表达。⑤ELISA检测结果显示：与DCN和DC.GFP比较，DC.FOXP3与CD4+T细胞共培养上清中IFN-γ、IL-17含量减低，IL-4、IL10含量增高。⑥DC.FOXP3与CD4+T细胞共培养体系中添加IDO拮抗剂1-MT后CD4+T细胞数量增加，凋亡细胞数减少，对CD4+CD25-T细胞极化作用减弱，Th1、Th17细胞的转录子及细胞因子mRNA水平增高，Th2、Treg细胞的转录子及细胞因子mRNA水平减低。ELISA法检测共培养液中分泌的细胞因子水平，IFN-γ、IL-17增高、IL-4、IL10减低。结论：1成功构建FOXP3基因过表达重组腺病毒载体。2成功培养、诱导、扩增大量DC，并鉴定了imDC和mDC的生物学特性和细胞表型。成功构建FOXP3基因高表达imDC细胞模型。3 AD-FOXP3转染后的imDC细胞表型无改变，下调自身Th1、Th17类炎性因子和上调Th2类抑制炎症因子的表达和分泌。并且细胞高表达IDO，从而增强了imDC的耐受原性。4 AD-FOXP3转染imDC可以在体外抑制EAE小鼠脾脏CD4+T细胞增殖、促进CD4+T细胞的凋亡、诱导Treg产生、抑制Th1和Th17功能,增强Th2和Treg功能,逆转了Th1/Th2和Th17/Treg细胞失衡。用IDO拮抗剂1-MT后EAE小鼠脾脏CD4+T细胞功能恢复,说明了DC.FOXP3可能通过激活IDO的功能促进免疫耐受。