【摘 要】
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马兜铃酸（Aristolochic acids,AAs）是天然存在于马兜铃科植物中的一类硝基菲有机酸类化合物。马兜铃科植物药理作用广泛、药用价值高,但研究发现马兜铃酸会对肾脏造成不同程度损伤,以及诱导基因突变,世界卫生组织将其列为I类致癌物。马兜铃酸I（Aristolochic acids I,AAⅠ）及其代谢物马兜铃内酰胺是马兜铃酸类化合物中最主要、毒性最强的成分,因此,如何有效的去除以马兜铃科
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马兜铃酸（Aristolochic acids,AAs）是天然存在于马兜铃科植物中的一类硝基菲有机酸类化合物。马兜铃科植物药理作用广泛、药用价值高,但研究发现马兜铃酸会对肾脏造成不同程度损伤,以及诱导基因突变,世界卫生组织将其列为I类致癌物。马兜铃酸I（Aristolochic acids I,AAⅠ）及其代谢物马兜铃内酰胺是马兜铃酸类化合物中最主要、毒性最强的成分,因此,如何有效的去除以马兜铃科为原料的中成药中的AAⅠ是国内外研究人员长期的研究目标。本课题利用实验室已有亲和小体噬菌体展示文库淘选并获得了靶向AAⅠ的亲和小体,并探索了该亲和小体在AAⅠ吸附减毒中的应用。主要的研究内容及结果如下:（1）分别以牛血清白蛋白（BSA）和卵清蛋白（OVA）为载体蛋白合成两种AAⅠ包被抗原,交替以BSA-AAⅠ和OVA-AAⅠ为靶蛋白,通过7轮富集淘选,获得并鉴定了1种与AAⅠ特异结合的亲和小体ZAAⅠ-A5。利用E.coli表达系统表达重组ZAAⅠ-A5蛋白并进行纯化,通过荧光淬灭实验研究了ZAAⅠ-A5与AAⅠ的相互作用特性,结果表明ZAAⅠ-A5与AAⅠ可特异性结合,室温下解离常数KD=14.80μM,相互作用力主要为氢键和范德华力。采用同源建模和分子对接模拟分析了ZAAⅠ-A5与AAⅠ的相互作用模式,结果表明ZAAⅠ-A5的R17侧链氨基中H原子与AAⅠ的亚硝基中O原子形成了一个氢键,ZAAⅠ-A5的W13、R18、Y24、T27、F28、I31均与AAⅠ存在疏水相互作用。（2）通过将自组装短肽ELK16和L6KD与ZAAⅠ-A5进行融合表达,制备靶向AAⅠ的亲和小体活性聚集体。利用E.coli表达融合蛋白,并通过破菌后离心实现了活性聚集体的高效制备。其中ZAAⅠ-A5-L6KD融合蛋白表达量高、组装效果好,离心制备纯度高,其与AAⅠ室温下的解离常数KD=12.43μM,与组装前基本一致,分子间相互作用力类型仍为氢键和范德华力,说明该亲和小体与AAⅠ的相互作用特性并未因蛋白质聚集行为发生改变。通过SEM和DLS对ZAAⅠ-A5-L6KD活性聚集体进行微观结构的初步表征,结果显示该聚集体为颗粒状,颗粒粒径在300 nm-900 nm范围内。蛋白酶水解实验证明ZAAⅠ-A5-L6KD自组装聚集体与普通包涵体不同,是仍然保留生物活性的活性聚集体,同时这种结构上的改变也极大地提升了重组蛋白质的稳定性。（3）基于Langmuir模型研究了ZAAⅠ-A5-L6KD对AAⅠ的等温静态吸附效果,模拟结果表明,ZAAⅠ-A5-L6KD对AAⅠ的吸附符合该模型,其最大吸附量为9.89 mg/g并且吸附能力高于阴性对照亲和小体的活性聚集体ZJ2-L6KD,证明了ZAAⅠ-A5-L6KD具有吸附AAⅠ的能力。同时选择性吸附实验发现ZAAⅠ-A5-L6KD对AAⅠ的结构类似物苯甲酸和硝基苯吸附能力较差,表明ZAAⅠ-A5-L6KD对AAⅠ的吸附具有特异性。综上,本课题成功开发了具有AAⅠ特异结合能力的亲和小体分子,设计并基于E.coli表达系统制备了该亲和小体的活性聚集体材料,最后研究了该材料对AAⅠ的选择性吸附能力。课题研究成果为以马兜铃科植物为原料的中成药“减毒存效”新技术的开发提供了重要的理论支撑与研究经验。
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