中华绒螯蟹、罗氏沼虾CyclinB基因cDNA克隆及其在卵子发生过程中表达分析

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本论文通过基因表达分析探讨了CyclinB在中华绒螯蟹和罗氏沼虾卵母细胞减数分裂成熟中的作用,对于了解虾蟹类卵母细胞成熟分裂机制具有重要学术价值,同时也可为生产上人工控制卵子成熟提供参考。 Cyclin B结合催化亚基Cdc2激酶形成促细胞成熟因子(MPF),从而参与调控了动物卵母细胞减数分裂。尽管Cyclin B的调控作用在很多种真核生物报道过,但是在甲壳动物中报道很少。本实验应用简并PCR和RACE方法第一次从中华绒螯蟹卵巢中克隆了cyclin B cDNA全长序列。该序列全长3,794 bp,包含编码410个氨基酸的开放阅读框和超长的的3’非翻译区(3’UTR)(2.4kb)。超长3’UTR存在潜在的翻译正调控元件TCE和转录后负调控元件K box(TGTGAT)。RT-PCR结果显示,cyclin B mRNA仅分布在卵巢、精巢和心脏组织中。在卵巢不同发育时期存在分化表达,在卵黄发生前的未成熟卵巢中表达量最高,卵黄发生前期和中期表达较低,在卵黄发生末期(lVt)和生发泡破裂(GBVD)期表达显著上升,表明CyclinB在卵原细胞的有丝分裂和卵母细胞减数分裂过程有着紧密联系。 蜕皮激素是一类所有节肢动物所含有的一种类固醇激素。在果蝇中,蜕皮激素被证明能够诱导昆虫卵母细胞减数分裂的重启。本实验通过体外注射的方法来探讨蜕皮激素对罗氏沼虾卵母细胞成熟分裂的诱导作用。每尾雌虾注射蜕皮激素工作液(10ng/g),直至全部蜕皮,对照组同时注射等量的1.2%的生理盐水。自然成熟组不注射任何试剂在同样饲养条件下自然成熟。激素实验组罗氏沼虾注射第一天开始蜕皮并在7天内全部蜕皮。自然成熟实验组第7天才有虾蜕皮在14天内全部蜕皮,而对照组在7天内没有发生蜕皮。进一步通过组织细胞观察发现激素实验组和自然成熟实验组生殖蜕皮10h后卵母细胞才完全进入减数分裂中期,表明了体外注射蜕皮激素能够提前诱导罗氏沼虾生殖蜕皮从而使得卵母细胞的减数分裂的重启提前。 为了从分子水平来探讨蜕皮激素对罗氏沼虾卵母细胞减数分裂重启的诱导作用,进一步研究了蜕皮激素对CyclinB基因表达的影响。首先,通过简并引物RT-PCR和RACE的方法克隆得到了罗氏沼虾CyclinB的cDNA全长。通过Real-timeRT-PCR检测,发现CyclinB mRNA在罗氏沼虾卵母细胞最终成熟过程中存在着差异表达,表明了CyclinB基因与罗氏沼虾减数分裂重启有着紧密关系。蜕皮激素实验组CyclinB基因在蜕皮5h、10h和14h表达量显著高于自然成熟组。同样,与对照组相比,注射蜕皮激素能显著增加CyclinB基因的表达,表明了罗氏沼虾卵母细胞成熟过程中,蜕皮激素能够促进CyclinB基因的表达,进一步表明了蜕皮激素卵母细胞减数分裂重启过程中发挥了重要作用。 综上,CyclinB基因在中华绒螯蟹和罗氏沼虾卵子发生过程中存在分化表达,特别是在生发泡破裂时期有着很高的表达,表明了CyclinB与中华绒螯蟹和罗氏沼虾卵母细胞减数分裂紧密相关。蜕皮激素能够使罗氏沼虾生殖蜕皮和生发泡破裂提前,并能够促进Cyclin B基因的表达,表明了蜕皮激素能够诱导罗氏沼虾卵母细胞减数分裂重启。
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