研究背景妊娠期高血压疾病是全世界范围内严重威胁母婴健康的妊娠期并发症,发病率为5%-12%。子痫前期(Preeclampsia,PE)在妊娠20周后发病,临床症状严重的子痫前期为重度子痫前期,妊娠34周之前发病的重度子痫前期称为早发性重度子痫前期(Early Onset Severe Preeclampsia,EOSP)。患者发病越早、病情越重,母儿预后越差。子痫前期的基本病理生理改变表现为患者全身小血管痉挛、血管内皮损伤和器官血液灌流量减少,多脏器出现缺血缺氧性损害,同时胎盘灌注不足可导致胎儿损伤。目前认为,胎盘浅着床是子痫前期发病的基础,导致胎盘长期缺血、氧化应激,释放异常胎盘因子进入母体血液循环,诱发子痫前期。有研究证实,EOSP是与胎盘发育缺陷关系最为密切的子痫前期类型。胎盘滋养细胞是胎盘向子宫内膜和肌层浸润的执行者,因此探索调控滋养细胞活性和功能的因素及其干预手段,是阐明子痫前期发病机制及指导其防治的关键点。TWIST1在多种人体组织和肿瘤中有调节细胞分化、抑制凋亡和增强侵袭等作用。TWIST1在胎盘滋养细胞中广泛表达,并且其表达量呈现孕周依赖性增加。文献报道TWIST1有促进滋养细胞分化和侵袭的能力,因此我们推测其可能在妊娠期胎盘相关性疾病--子痫前期的发病中有重要的作用,但两者之间的相关性需要进一步证实。此外,TWIST1是否对介导滋养细胞的凋亡发挥作用也尚未明确。低分子肝素(Low Molecular Weight Heparin,LMWH)和阿司匹林(Aspirin)是目前临床上公认有效的降低子痫前期发病风险的药物,有研究表明LMWHH和Aspirin可以直接调节滋养细胞的活性和功能,但作用机制未明。第一部分EOSP患者与体外缺氧模型中滋养细胞凋亡率及TWIST1表达背景及目的:在妊娠早期,胎盘滋养细胞处于生理性缺氧状态,随后滋养细胞逐渐浸润至子宫内膜直至肌层的内1/3,并进入子宫螺旋小动脉管腔取代血管内皮,导致管腔增大、弹性增加。胎盘的绒毛面积逐渐扩大,子宫-胎盘的血流供应阻力降低、血容量增加,胎盘滋养细胞的缺氧状态得到纠正。胎盘滋养细胞凋亡率增加和侵袭能力下降会引起胎盘浸润不足和子宫血管重铸障碍,导致胎盘供血不足和滋养细胞氧化应激,最终导致子痫前期的发生。TWIST1促进滋养细胞分化和侵袭的作用已被证实,但其在子痫前期患者滋养细胞中的表达情况未见报道。在第一部分中,首先对EOSP患者和匹配孕周非高血压孕妇分娩的新生儿重量、评分以及胎盘重量进行比较,并检测两组间胎盘TWISTI的表达和滋养细胞凋亡率的差异,然后在体外模拟妊娠早期和子痫前期患者胎盘滋养细胞的缺氧状态,检测TWIST1表达和细胞凋亡率的变化。方法:1.采用回顾性研究,对2016.12-2018.10年间分娩的27例EOSP患者与31例孕周相匹配的非高血压孕妇分娩的新生儿体重、Apgar评分和胎盘重量的差异进行统计分析。2.利用Western blot、PCR和免疫组化检测EOSP患者和孕周相匹配的非高血压孕妇胎盘中TWIST1的表达;利用Tunel染色和Western blot检测两组间胎盘滋养细胞的凋亡情况。3.在体外缺氧模型中,利用Western blot检测滋养细胞TWIST1的表达;利用Hoechst 33258染色和Annexin V检测细胞增殖和凋亡的情况。结果:1.与同孕期分娩的非高血压孕妇相比,EOSP患者分娩的新生儿体重、Apgar评分及胎盘重量明显降低。2.与同孕期分娩的非高血压孕妇相比,EOSP患者胎盘中TWIST1表达降低,滋养细胞凋亡率增加;3.缺氧可导致体外培养的滋养细胞TWIST1表达降低、细胞凋亡率升高,而且呈现时间依赖性。结论:EOSP患者的新生儿不良结局发生率高;胎盘滋养细胞TWIST1表达降低与细胞凋亡率升高及EOSP发病具有正相关性。第二部分TWIST1在缺氧滋养细胞中的作用背景及目的:在女性生殖功能中,TWIST1有调节子宫基质细胞蜕膜化、胚胎发育和器官分化的作用。胎盘的发育和肿瘤的生长在诸多方面有极其相似的特点,因此可以推测TWIST1对肿瘤细胞凋亡的调控机制也作用于滋养细胞中。在本章中,着眼于缺氧引起的滋养细胞活性和功能的改变,通过调节TWIST1的表达,检测缺氧滋养细胞增殖、凋亡、侵袭、血管生成能力等方面的变化,从而深入探讨TWIST1在胎盘发育和子痫前期发病机制中的作用。方法:1.通过转染过表达TWIST1的质粒获得过表达TWIST1的细胞株,借助慢病毒载体获得干扰TWIST1表达的稳定细胞株,并对上述细胞株进行缺氧培养。2.利用 Edu 染色、Hochst33342 染色、Annexin V 和 Western blot 检测缺氧模型中TWIST1过//低表达对滋养细胞增殖、凋亡、凋亡相关蛋白(Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9)和侵袭相关蛋白(MMP-2、MMP-9)表达的作用。3.利用平板克隆、Transwell、血管形成实验检测缺氧模型中TWIST1过/低表达对滋养细胞克隆形成能力、细胞迁移和侵袭以及血管生成能力的作用。4.利用流式细胞术检测缺氧模型中TWIST1过/低表达对滋养细胞ROS和线粒体膜电位的作用。结果:1.过表达TWIST1抑制缺氧引起滋养细胞的凋亡,促进细胞增殖,凋亡相关蛋白也发生相应变化;而低表达TWIST1则促进细胞的凋亡、抑制细胞的增殖。2.过表达TWIST1可以逆转缺氧导致的滋养细胞克隆形成、血管生成能力、细胞迁移和侵袭能力的降低,伴随着侵袭相关蛋白表达的升高;而低表达TWIST1则进一步加剧缺氧导致的滋养细胞侵袭能力的降低。3.过表达TWIST1降低缺氧滋养细胞的活性氧簇(Reactive Oxygen Species,ROS)水平,提高细胞线粒体膜电位;而低表达TWIST1进一步加剧缺氧导致的滋养细胞ROS增加和线粒体膜电位下降。结论:TWIST1参与缺氧状态下滋养细胞的增殖、凋亡、血管形成、细胞迁移能力的调节,抑制细胞凋亡,促进细胞侵袭。第三部分 凋亡激活剂/抑制剂对TWIST1调节缺氧滋养细胞凋亡的影响背景及目的:细胞凋亡是基因控制的细胞自主有序的死亡,目前已确定的是线粒体途径、死亡受体途径和内质网途径三条通路,其中线粒体途径是哺乳动物中最重要的凋亡通路。线粒体途径激活后,线粒体膜电位和凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax比降低,进而启动Caspase家族级联反应,导致凋亡。Caspase-9是线粒体凋亡途径中承上启下的关键因子,而Caspase-3是三条凋亡通路的共同底物,是细胞凋亡的执行者。我们之前的研究证实,TWIST1可以调节缺氧滋养细胞的凋亡,同时伴随着线粒体途径中凋亡相关蛋白和线粒体膜电位的变化,提示TWIST1可能影响滋养细胞的线粒体凋亡途径。在本章中,通过在缺氧滋养细胞模型中分别加入Caspase-3的激活剂以及Caspase-9的激活剂/抑制剂,进一步探讨TWIST1调节滋养细胞凋亡的作用机制。方法:1.在缺氧滋养细胞模型中过表达TWIST1,并加入Caspase-3的激活剂(PAC-1)、Caspase-9 的激活剂(YC137)或抑制剂(Z-LEHD-FMK),利用 Hoechst染色和Annexin V检测细胞凋亡的情况。2.利用Western blot检测加入Caspase-3的激活剂、Caspase-9的激活剂或抑制剂后的缺氧滋养细胞中线粒体凋亡相关蛋白(Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9)和侵袭相关蛋白(MMP-2、MMP-9)的表达。结果:1.过表达TWIST1抑制了缺氧导致的滋养细胞凋亡,加入Caspase-3和Caspase-9激活剂均可逆转TWIST1对细胞凋亡的保护性作用,而加入Caspase-9抑制剂则增强了 TWIST1抑制凋亡的作用。2.过表达TWIST1抑制了缺氧对滋养细胞凋亡相关蛋白和侵袭相关蛋白表达的影响,加入Caspase-3和Caspase-9激活剂后逆转了其作用效果,而加入Caspase-9抑制剂后增强了其作用效果。结论:TWIST1通过介导线粒体凋亡途径发挥调节缺氧滋养细胞凋亡的作用。第四部分TWIST1调节Aspirin和LMWH影响滋养细胞活性和功能的机制背景及目的:Aspirin和LMWH降低子痫前期发病风险的作用已得到公认。研究证实,除通过发挥抗凝作用改善胎盘循环外,Aspirin和LMWH也可直接作用于胎盘滋养细胞,调节其活性和功能,但其作用机制尚未完全明确。在本章中,在缺氧培养的滋养细胞中加入Aspirin和LMWH,探讨药物对滋养细胞凋亡和侵袭功能的影响;此外,通过干扰TWIST1的表达进一步探讨Aspirin和LMWH对滋养细胞发挥作用的机制。方法:1.用不同剂量Aspirin和LMWH处理缺氧滋养细胞,利用Annexin V检测细胞凋亡率的变化,选择对细胞凋亡影响最明显且浓度最低的药物剂量。2.利用Edu染色、transwell检测Aspirin和LMWH对缺氧滋养细胞增殖和侵袭能力的影响;利用Real-time PCR、Western blot和免疫荧光检测Aspirin和LMWH对缺氧滋养细胞TWIST1表达、凋亡相关蛋白表达和侵袭相关蛋白表达的影响;利用流式细胞术检测Aspirin和LMWH对缺氧滋养细胞ROS和线粒体膜电位的影响。3.在缺氧滋养细胞模型中低表达TWIST1,利用Edu染色、Annexin V、Transwell和Western blot检测Aspirin和LMWH对滋养细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭能力的影响;利用流式细胞术检测干扰TWIST1表达后Aspirin和LMWH对缺氧滋养细胞ROS和线粒体膜电位的影响。结果:1.Aspirin和LMWH降低缺氧滋养细胞的凋亡率,增加其增殖和侵袭能力;Aspirin和LMWH逆转缺氧导致的TWIST1表达、凋亡和侵袭相关蛋白变化;Aspirin和LMWH逆转缺氧引起的滋养细胞ROS升高和线粒体膜电位下降。2.低表达TWIST1逆转Aspirin和LMWH对缺氧滋养细胞增殖、迁移和凋亡的保护性作用,削弱Aspirin和LMWH对缺氧滋养细胞ROS和线粒体膜电位的影响。结论:Aspirin和LMWH可以通过促进TWIST1的表达抑制缺氧滋养细胞的凋亡,促进细胞侵袭,在胎盘发育和子宫血管重铸过程中发挥保护性作用。这一机制的明确为Aspirin和LMWH用于子痫前期的早期预防提供了理论依据。小结在本论文中,首先通过比较EOSP患者与非高血压孕妇分娩的新生儿结局和胎盘重量的差异,以及两组孕妇胎盘TWIST1表达及细胞凋亡率的差异,发现EOSP患者胎儿预后不良,胎盘滋养细胞TWIST1表达降低和细胞凋亡率增加。然后,模拟妊娠早期及子痫前期患者滋养细胞的缺氧状态,建立细胞模型,研究TWIST1对滋养细胞凋亡和侵袭浸润功能的影响,并深入探讨其调节滋养细胞凋亡的机制,发现TWIST1可以通过介导线粒体凋亡途径降低缺氧导致的细胞凋亡,并促进细胞侵袭。最后,在缺氧培养的滋养细胞中加入Aspirin和LMWH,检测细胞活性和功能的变化,并通过干扰TWIST1的表达探讨药物的作用机制,发现Aspirin和LMWH可以通过促进TWIST1的表达降低滋养细胞的凋亡,增强其侵袭能力。