论文部分内容阅读
目的:本研究旨在应用牛蒡子中木脂素类成分牛蒡酚F(Lappaol F,LAF)对肿瘤细胞进行干预,观察LAF对多种肿瘤细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响;研究LAF对致癌基因Yes-Associated Protein(YAP)及其靶基因表达的影响;进一步研究LAF对YAP的调控方式,从而探讨LAF抗肿瘤作用的机制。方法:(1)磺酰罗丹明B法检测LAF对人宫颈癌Hela细胞、人结肠癌SW480细胞、人前列腺癌PC3细胞、人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖活性的影响;(2)Annexin V-FITC/PI双染-流式检测法,检测不同浓度的LAF对四种肿瘤细胞凋亡的影响;(3)多功能实时无标记细胞分析仪研究LAF对Hela细胞和MDA-MB-231细胞迁移和侵袭的抑制作用;(4)Western Blot法检测LAF对YAP表达水平的影响,以及对YAP靶基因(BIRC5、Bcl-2、C-myc)表达的影响;(5)免疫荧光法检测LAF对YAP在亚细胞水平定位表达的影响;(6)Western Blot法检测YAP调控蛋白14-3-3 σ的表达水平;(7)siRNA干扰法敲减14-3-3σ表达,通过免疫荧光法检测14-3-3σ表达下调对YAP表达及定位的影响,以及LAF的逆转作用。结果:(1)LAF(10-75 μmol/L)能够显著抑制Hela细胞、SW480细胞、PC3细胞和MDA-MB-231细胞的增殖,且随着LAF浓度的增加和作用时间的延长,其抑制作用增强。当LAF(50 μ mol/L)作用48h时,四种肿瘤细胞的存活率约为50%。(2)LAF(25 μ mol/L-75 μ mol/L)作用 48h,能够诱导 Hela 细胞、SW480 细胞、PC3细胞和MDA-MB-231细胞发生凋亡,且该作用呈明显的浓度梯度。(3)LAF(10-50 μ mol/L)预处理细胞48h,能够显著抑制Hela细胞和MDA-MB-231细胞的迁移与侵袭。且随着LAF浓度的增加,其抑制这两种肿瘤细胞迁移、侵袭的作用呈明显的浓度梯度。与Hela细胞比较,LAF对MDA-MB-231细胞的迁移、侵袭抑制作用更为明显。当LAF作用浓度为50 μmol/L时,MDA-MB-231细胞的迁移率与侵袭率仅为不加药对照组细胞的6.6%与24.7%。(4)LAF(10-50 μmol/L)分别作用 24h、48h 和 72h 后,Hela 细胞、SW480 细胞、PC3细胞和MDA-MB-231细胞中YAP及其靶基因C-myc、BIRC5、Bcl-2蛋白的表达量均显著下降,且随着LAF浓度的增加和作用时间的延长,其对YAP和靶基因的抑制作用呈明显的剂量和时间梯度;作为YAP的抑制剂,阳性对照药物VP 1 μ mol/L同样能够显著降低四种肿瘤细胞中YAP及其靶基因C-myc、BIRC5、Bcl-2蛋白的表达量。(5)免疫荧光结果显示,LAF可明显抑制YAP的细胞核内水平。(6)LAF(10-50 μmol/L)分别作用 24h、48h 和 72h 后,Hela 细胞、SW480 细胞、PC3细胞和MDA-MB-231细胞YAP调控蛋白14-3-3 σ的表达量均显著增加,且随着LAF浓度的增加和作用时间的延长,其对14-3-3 σ基因表达的促进作用呈明显的浓度和时间梯度。(7)免疫荧光结果显示,siRNA干扰法抑制14-3-3 σ表达后,YAP的核内表达水平增加。伴随LAF对14-3-3 σ的促表达作用受到抑制,其对YAP的表达抑制作用也明显减弱。结论:LAF能够显著抑制体外人宫颈癌Hela细胞、人结肠癌SW480细胞、人前列腺癌PC3细胞、人乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖、迁移和侵袭;并促进这四种肿瘤细胞发生凋亡。其机制可能是通过增加14-3-3 σ的表达水平,促进其与YAP结合,使YAP滞留于细胞质中继而被降解,从而抑制由YAP介导的促增殖、迁移侵袭和抑凋亡作用,发挥抗肿瘤作用。