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发菜,学名发状念珠藻(Nostoc flagelliforme),是一种具有较高食用及药用价值的光能自养型蓝藻。在生长代谢过程中,发菜细胞向胞外分泌大量的发菜多糖,对细胞起到保护作用,同时研究发现其亦具有抗氧化、抗病毒、抗肿瘤以及提高免疫等生物活性,有一定的药用价值。在盐胁迫条件下,发菜多糖分泌量增加。前期对盐胁迫及正常培养条件下的发菜样品进行转录组测序分析,挖掘参与发菜响应高盐胁迫的相关基因。本课题在转录组测序结果的基础上,筛选出部分可能参与盐胁迫下发菜多糖代谢相关的差异表达基因,以发菜基因组为模板,对其进行克隆与表达,分析差异表达基因的基本特征,丰富发菜的基因数据,为进一步研究发菜多糖的代谢调控机制提供理论基础。对发菜中的三个糖基转移酶基因(GT1、GT2、GT3)、GDP-甘露糖4,6-脱水酶基因(GMD)、多糖输出蛋白基因(PEP)进行克隆,得到基因序列,分别对其进行生物信息学分析,结果如下:GT1、GT2、GT3、GMD、PEP基因序列大小分别为1290 bp、1173 bp、948 bp、1080 bp、1467 bp,核酸序列分析均具有较高的保守性。GT1、GT2、GT3、GMD、PEP蛋白分子量大小分别为47.54 k Da、43.16 k Da、35.99 k Da、41.08 k Da、51.28 k Da,理论等电点分别为9.33、7.64、6.34、5.73、5.50。GT1、GT2、GT3、GMD、PEP均为亲水性蛋白,不具有跨膜活性。GT1、GT2、GT3的二级结构主要为随机卷曲和α螺旋,GMD和PEP的二级结构为随机卷曲、α螺旋和折叠。将GT1、GT2、GT3、GMD、PEP进行扩增,与载体p ET28a连接,IPTG诱导其在大肠杆菌BL21中表达,分别以IPTG浓度、加入IPTG时菌液OD值、培养温度为变量进行单因素实验,SDS-PAGE蛋白电泳比较目的蛋白的表达效果,确定目的蛋白表达的适宜条件。结果表明,蛋白表达的条件为:IPTG终浓度为1 m M,加入IPTG时菌液OD值为0.8,加入IPTG后培养温度为16℃,在该条件下,四种蛋白均表达得到了与预期大小一致的重组蛋白。研究结果为进一步研究GT1、GT2、GT3、GMD的结构、功能及在发菜多糖代谢调控中的作用奠定了基础,为研究发菜多糖的代谢调控机制提供了理论依据和实验思路。