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目的:真菌性角膜炎(Aspergillus fumigatus,AF)是由致病真菌侵犯受损角膜导致的感染性角膜炎,是因缺乏有效的治疗的棘手疾病之一。细胞焦亡在抵御微生物入侵的先天免疫阶段中发挥着重要作用。GSDMD蛋白是焦亡过程中关键执行者,也是不同焦亡途径的通用底物。本研究中,我们重在探究GSDMD蛋白在由烟曲霉菌诱导的小鼠真菌性角膜炎中的作用及机制。方法:1.收集临床上感染真菌性角膜炎患者和正常对照组患者的角膜组织,采用免疫荧光法检测非感染和感染真菌的人角膜中GSDMD蛋白的表达。使用烟曲霉菌分生孢子刺激人永生化角膜上皮细胞(Human corneal epithelium cells,HCECs),通过定量聚合酶链式反应(Reverse transcription-PCR RT-PCR)和Western Bolt法检测正常和烟曲霉菌刺激4h、8h、12h、16h的HCECs中GSDMD蛋白的表达;细胞免疫荧光法检验正常和烟曲霉菌刺激8h后的HCECs中GSDMD蛋白的表达。2.基质内注入烟曲霉菌分生孢子建立12h、1d、2d、3d、5d、7d、10d、14d小鼠真菌性角膜炎动物模型,利用PCR、Western Bolt和免疫荧光法分别对GSDMD蛋白实行定量和定位检测。3.IFNR抑制剂hydrochloride、JAK/STAT抑制剂Ruxolitinib和Caspase-1抑制剂Belnacasan分别对HCECs进行预处理,建立真菌感染的细胞模型。烟曲霉菌刺激12h和16h后收集HCECs,通过PCR、Western Bolt和免疫荧光法依次检测细胞中GSDMD蛋白的表达。4.使用GSDMD siRNA预处理小鼠角膜后建立动物真菌性角膜炎模型,感染1d时,用裂隙灯显微镜记录小鼠角膜感染情况并标记临床评分,用免疫荧光法检测小鼠角膜中中性粒细胞和巨噬细胞的募集情况,用PCR和Western Bolt法检测小鼠角膜中GSDMD和IL-1β表达。结果:1.GSDMD在人正常角膜组织中几乎不表达,但真菌感染后的荧光染色较人正常角膜组明显增强。在HCECs感染模型中,烟曲霉菌感染组中GSDMD mRNA和蛋白水平表达均比正常对照组高。2.在动物感染模型中,与正常对照组相比,真菌感染组小鼠角膜中GSDMD mRNA和蛋白水平均明显升高。3.IFNR抑制剂hydrochloride、JAK/STAT抑制剂Ruxolitinib和Caspase-1抑制剂Belnacasan预处理后,相对于正常对照组,烟曲霉菌刺激组中GSDMD的mRNA和蛋白水平升高的趋势被显著抑制。4.GSDMD siRNA干预小鼠角膜后,与烟曲霉菌感染组相比,小鼠角膜炎症反应程度明显减轻,临床评分有效下降,基质内中性粒细胞和巨噬细胞浸润明显减少,组织中GSDMD和IL-1β的mRNA和蛋白水平均显著降低。结论:焦亡关键蛋白GSDMD参与真菌性角膜炎的免疫过程。在烟曲霉菌性角膜炎中,可以通过阻断IFNR,JAK/STAT,Caspase-1信号传导途径来调控GSDMD的活性继而影响中性粒细胞和巨噬细胞的募集及炎症因子IL-1β的分泌。因此,GSDMD将会成为新型治疗真菌性角膜炎的靶标。