目的：泛素介导的蛋白质降解可调控细胞内大量生命活动，包括细胞周期、DNA修复、转录调控、免疫应答和信号传导。泛素与蛋白质的连接是由泛素活化酶E1、泛素结合酶E2和泛素-蛋白连接酶E3依次催化完成的。去泛素化酶(DUB)通过去除蛋白质上连接的泛素，从而对蛋白质的泛素化进行负向调节。人类基因组编码大约95种DUB，按其序列相似性和作用机制可分为五个家族，分别是：泛素特异性蛋白酶(USPs)、泛素羧基末端水解酶(UCHs)、卵巢肿瘤相关蛋白酶(OTUs)、含Machado-Joseph结构域的MJD和含金属蛋白酶结构域的JAMM蛋白酶。　　 USP是DUB中种类最多、成员结构最为多样的一个家族。尽管不同的USP长短不等、结构各异，但它们的氨基酸序列中都含有高度保守的半胱氨酸(Cys)、组氨酸(His)和天冬氨酸(Asp)结构域。目前研究发现，USP调控大量体内生物和病理进程，包括稳定肿瘤抑制因子p53、调控细胞生长、抑制凋亡、调控发育进程和抑制基因沉默等。　　 本研究从大鼠脑组织和人类A549肿瘤细胞株中分离了一个新的泛素特异性蛋白酶基因usp12。同时分析了大鼠usp12基因在各组织中的分布情况，并对其去泛素化酶活性进行了研究。大鼠和人类USP12均具有去泛素化酶活性，但人类USP12的SNP，第173位组氨酸突变为天冬氨酸后不能剪切底物，表明该SNP可能具有重要作用。　　 方法：　　 (1)大鼠usp12的克隆。利用TRNzol从大鼠脑组织中提取总RNA，反转录合成第一链cDNA，并利用usp12的特异引物进行PCR扩增。PCR产物克隆至pGEM-T easy载体并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。经BamHI和SalI酶切检测后，含预期大小条带的质粒进一步测序鉴定。　　 (2)大鼠usp12的组织分布通过实时荧光定量PCR技术进行分析。首先从大鼠大脑、心、肾、肝、肺、骨骼肌、脾和睾丸等组织中提取总RNA。以大鼠usp12与GAPDH特异引物和一步法real-time PCR试剂盒进行PCR扩增。结果的计算基于荧光信号到达阈值所需循环数（Ct值），最后求得2-ΔΔCt即为各组织usp12的相对表达水平。　　 (3)大鼠USP12融合蛋白的表达。经BamH I和Sal I酶切后，将大鼠usp12插入GST表达质粒pGEX-6p-1并转化DH5α感受态细胞。经IPTG诱导4小时后，细菌总裂解液及其上清和沉淀进行10％SDS-PAGE分析。　　 (4)去泛素化酶活性分析。表达质粒pGEX-6p-1，pRB-UBP2，pGEX-rusp12和pGEX-rusp12(C48S)与pAC-ub-met-β-gal共转化大肠杆菌BL21感受态细胞。经IPTG诱导后，7％SDS-PAGE并利用小鼠抗β-gal抗体进行蛋白质的印迹分析。　　 (5)人类usp12的克隆。利用TRNzol从人类A549细胞中提取总RNA，并利用usp12特异引物进行PCR反应。将usp12插入pGEX-6p-1，并利用PfuDNA聚合酶对氨基酸第173位组氨酸进行点突变。以Ub-Met-β-gal进行去泛素化酶活性分析。　　 结果：　　 (1)大鼠USP12基因编码区含1113个碱基，编码370个氨基酸，推测其分子量为43KDa。它含有泛素特异性蛋白酶高度保守的半胱氨酸、组氨酸和天冬氨酸结构域。　　 (2)Usp12在大鼠各组织中均有表达，在脾和肺中表达较多，在睾丸、肾、大脑和肝中表达量居中，在心和骨骼肌中表达较少(3)经IPTG诱导和SDS-PAGE检测可发现在大肠杆菌DH5α中表达出GST-USP12融合蛋白，其分子量大约为70KDa。　　 (4)去泛素化酶活性分析表明大鼠USP12可将底物Ub-Met-β-gal上的泛素去除，其具有去泛素化酶活性。　　 (5)人类USP12基因编码区含1113个碱基，编码370个氨基酸，推测其分子量为43KDa。野生型人类USP12具有去泛素化酶活性，但SNP突变型，即第173位组氨酸突变为天冬氨酸后，不能检测到活性。　　 结论：　　 (1)从大鼠脑组织克隆出大鼠泛素特异性蛋白酶USP12。　　 (2)Usp12在大鼠各组织中均有表达，以脾脏、肾脏中表达最多。　　 (3)大肠杆菌DH5α中表达出GST-USP12融合蛋白。　　 (4)大鼠USP12具有去泛素化酶活性。　　 (5)从人类A549细胞株中克隆出USP12基因，证明其具有去泛素化酶活性，H173D突变后活性消失。