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[目的]本实验室在之前骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)移植治疗阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)大鼠模型中发现,BMSCs可以改善AD大鼠的学习记忆能力,并且在治疗后的大鼠海马组织中发现了 血小板衍生生长因子-BB(Platelet derived growth factor-BB,PDGF-BB)表达显著升高。本研究将通过体外细胞实验进一步阐明PDGF-BB在BMSCs治疗AD中的作用机制。[方法]首先以HIV慢病毒为载体构建APP695过表达的慢病毒重组体对人神经母细胞瘤细胞株(SH-SY5Y)进行转染,然后用嘌呤霉素筛选稳转细胞株,构建AD的体外细胞模型即APP695过表达的SH-SY5Y细胞(后简称SH-SY5Y-APP695)。BMSCs与SH-SY5Y-APP695通过细胞培养小室进行非接触式共培养72h后,通过倒置相差显微镜观察共培养后SH-SY5Y-APP695的形态变化,并通过免疫荧光染色检测神经细胞的标志物TuJ1的表达情况。采用ELISA检测SH-SY5Y-APP695中A β 1-42和PDGF-BB的表达变化,并用Q-PCR和Western blot 检测 SH-SY5Y-APP695 中 PDGF-BB 和 PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、SYP和GAP43的表达变化。然后,以HSV为病毒载体构建PDGF-BB的干扰(HSV-sh-PDGF-BB)疱疹病毒重组体,进行PDGF-BB的体外功能研究。用PI3K信号通路的抑制剂LY294002研究PI3K信号通路在BMSCs治疗AD中的作用,阐明BMSCs共培养对AD的治疗作用中PDGF-BB和PI3K/AKT信号通路的相互作用机制。[结果]1.BMSCs共培养改善Aβ 1-42处理的SH-SY5Y细胞活力,提高PDGF-BB的mRNA水平。MTT实验结果显示:Aβ 1-42处理后的SH-SY5Y细胞活力相对于sham组显著降低(P=0.00<0.05),与Aβ 1-42组比较Aβ 1-42+BMSC组的细胞活力显著回升(P=0.007<0.05)。Q-PCR 结果显示:A β 1-42 组与 sham 组比较 PDGF-BB mRNA水平有降低的趋势,但是无统计学意义(P=0.0911>0.05);Aβ 1-42+BMSC组与Aβ 1-42组比较,A β 1-42+BMSC组的PDGF-BB的mRNA水平显著升高(P=0.001<0.05)。2.APP695的过表达导致SH-SY5Y细胞的突起变短,Aβ1-42表达增多,细胞活力下降。免疫荧光检测结果显示:APP组相比较于NC组,细胞从形态上看突起变短,细胞表面变的粗糙;MTT结果显示:APP组相比较于NC组,细胞活力显著下降(P=0.007<0.05);Q-PCR和ELISA结果显示:sham组与NC组比较Aβ1-42的mRNA(P=0.646>0.05)和蛋白水平(P=0.999>0.05)变化无明显差异,APP组相较于NC组Aβ 1-42的mRNA(P=0.000<0.05)和蛋白水平都显著升高(P=0.012<0.05)。3.BMSCs共培养显著改善AD体外细胞模型的细胞活力,并且显著提高AD细胞模型中PDGF-BB的mRNA及蛋白水平,降低APP的mRNA和Aβ 1-42的蛋白水平,升高PI3K及AKT的mRNA水平。MTT结果显示:APP+BMSC组的细胞活力较APP组显著提高(P=0.033<0.05);Q-PCR 及 Elisa 结果显示:APP+BMSCs 组相较于 APP 组,PDGF-BB 的 mRNA(P=0.000<0.05)和蛋白(P=0.000<0.05)水平都显著提高,Aβ1-42的mRNA(P=0.000<0.05)和蛋白水平(P=0.000<0.05)显著降低,同时 PI3K(P=0.000<0.05)和 AKT(P=0.000<0.05)的 mRNA 水平显著上升。4.PDGF-BB和PI3K信号通路干扰后BMSCs共培养对AD细胞模型的活力改善作用及促进AD细胞模型的Aβ 1-42的清除作用下降,并且PI3K/AKT信号通路关键分子PI3K及AKT的磷酸化形式蛋白和突触相关蛋白GAP43、SYP的表达水平降低。APP+sh-PDGF-BB+BMSC 组与 APP+HSV+BMSC 组比较,APP+sh-PDGF-BB+BMSC组AD细胞形态发生明显的改变,细胞表面变的粗糙,细胞突起变短,MTT结果显示其细胞活力显著下降(P=0.043<0.05),PDGF-BB的 mRNA(P=0.000<0.05)和蛋白水平(P=0.000<0.05)都下降,而 Aβ1-42 的mRNA(P=0.000<0.05)和蛋白水平(P=0.000<0.05)都显著升高,且信号通路PI3K/AKT 的关键分子 PI3K(P=0.000<0.05)及 AKT(P=0.000<0.05)的 mRNA水平,p-PI3K(P=0.000<0.05),p-AKT(P=0.000<0.05)的蛋白水平都显著下降,同时 GAP43(P=0.000<0.05)和 SYP(P=0.000<0.05)的蛋白水平显著下降。PI3K 信号通路抑制后,APP+LY294002+BMSC 组于 APP+DMSO+BMSC 组比较,APP+LY294002+BMSC组细胞形态发生明显的变化,表现在胞体面积变小,细胞突起变短,MTT结果显示细胞活力显著下降(P=0.000<0.05),Aβ1-42的mRNA水平(P=0.000<0.05)及蛋白水平(P=0.000<0.05)显著升高,PI3K(P=0.000<0.05),AKT(P=0.000<0.05)的 mRNA 水平及 p-PI3K(P=0.000<0.05)p-AKT(P=0.001<0.05),GAP43(P=0.000<0.05)和 SYP(P=0.000<0.05)的蛋白水平显著降低。[结论]在BMSC与SH-SY5Y-APP695共培养中,PDGF-BB通过激活PI3K-AKT信号通路的磷酸化,显著降低了A β1-42的沉积,提高了 GAP43,SYP的蛋白水平,从而改善了 AD细胞模型SH-SY5Y-APP695细胞株的细胞活力,促进了 AD细胞模型的病理学损伤修复。