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毛囊干细胞位于毛囊隆突内,是维持成体皮肤稳态和毛发再生的重要基础。毛囊干细胞自我更新和分化之间平衡的保持是毛囊干细胞发挥功能的关键。两者间平衡的破坏会引起皮肤肿瘤或者干细胞耗竭的发生。WNT/β-catenin和BMP信号通路在毛囊干细胞分化和动员过程中发挥重要作用。PTEN(10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物)通过使3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)去磷酸化,抑制PI3K/AKT信号通路多个信号分子的活化。其中最重要的一个效应分子是AKT,AKT的活化会导致细胞周期加快,细胞凋亡抑制以及蛋白翻译增加等。在其它组织干细胞中的研究表明,Pten基因对多种干细胞的维持非常重要,但Pten基因是否在毛囊干细胞动员和维持中发挥作用,却未见相关报道。我们通过免疫组化发现,PTEN在表皮角质细胞和毛囊干细胞中表达,提示PTEN可能在毛囊干细胞动员和维持中发挥作用。我们以前的研究证实,角蛋白5(K5)的启动子能够指导Cre重组酶在小鼠毛囊干细胞中成功表达。本研究中发现,该转基因小鼠能在小鼠的整个表皮和毛囊中剔除Pten基因。我们通过检测AKT磷酸化的水平,发现在Pten基因敲除小鼠的表皮和包括隆突在内的整个毛囊中AKT磷酸化水平显著升高。Pten基因敲除小鼠毛囊生长期提前,静息期缩短,毛囊周期加快,同时表皮显著增厚,角质细胞增殖增加。短期核苷酸类似物BrdU(bromodeoxyuridine)标记滞留实验能够显示出表皮和毛囊增殖旺盛的区域。给出生后23天小鼠,连续3天分3次腹腔注射BrdU,滞留34天后检测BrdU信号。结果表明在毛囊峡部和表皮基底层等细胞增殖比较旺盛的部分,Pten基因敲除小鼠的标记滞留细胞显著减少。为研究Pten基因敲除对毛囊干细胞数量的影响,我们检测了两种常用的毛囊干细胞标记分子K15和CD34在对照和Pten基因敲除小鼠静息期毛囊中的表达情况。结果发现Pten基因敲除小鼠与对照小鼠相比,每个静息期毛囊中CD34和K15表达没有发生显著改变。流式细胞术检测发现,与对照小鼠相比,Pten基因敲除小鼠毛囊干细胞在表皮所有角质细胞中的比例下降(8.74%±1% vs 6.78±0.7%,p<0.01, n=3)。流式细胞术与原位检测之间产生差异的主要原因是Pten基因敲除小鼠表皮增厚,角质细胞数量增加,因此毛囊干细胞的比例会下降。利用干细胞细胞周期比其子代细胞周期缓慢的原理,我们利用长程BrdU标记滞留实验检测毛囊干细胞。具体做法是给出生后10天小鼠连续2天分4次腹腔注射BrdU,60-77天后通过免疫组化检测BrdU标记滞留细胞。被掺入BrdU的终末分化细胞会从皮肤表面脱落,具有较强增殖能力的临时增殖细胞其掺入核内的BrdU会因为反复增殖而被逐渐稀释,最终呈现BrdU阳性的细胞则是细胞周期缓慢的毛囊干细胞。注射60天后检测BrdU标记滞留细胞,发现在对照和Pten基因敲除小鼠的毛囊隆突都能存在很多BrdU标记滞留细胞。而注射77天后再次检测BrdU标记滞留细胞,结果显示在对照小鼠的毛囊隆突存在BrdU标记滞留细胞,而Pten基因敲除小鼠的毛囊和整个表皮的细胞中都基本检测不到BrdU标记滞留细胞。说明Pten基因敲除会促进毛囊干细胞动员。利用CD34和Ki67抗体荧光双标记检测,发现对照小鼠毛囊中表达CD34的细胞基本不表达Ki67,而Pten基因敲除小鼠毛囊CD34阳性的细胞其中一些是Ki67阳性的。这就直接证明了Pten基因敲除后小鼠毛囊干细胞动员确实加快。我们利用干细胞克隆形成实验在体外进一步证明了Pten基因敲除小鼠的毛囊干细胞动员加快。将Pten基因敲除小鼠和对照小鼠皮肤中原代分离的相同数目的角质细胞在有小鼠胚胎成纤维细胞做滋养层的体系中培养,对克隆形成的速度和大小进行统计和分析。发现来自Pten基因敲除小鼠的细胞克隆形成速度快,但小克隆较多。其中细胞数在32-200的小克隆约占全部克隆的63%,而对照小鼠是41%。细胞数大于1000的大克隆只占全部克隆的1.37%,而对照小鼠是18%。Ki67免疫荧光染色结果显示Pten基因敲除角质细胞形成的大克隆中细胞增殖能力显著下降。这些数据一定程度上说明在一个干细胞自我更新不能维持的体系中,Pten基因敲除的表皮干细胞会由于动员加快而迅速失去分化的潜能。综上所述,我们首次证明Pten基因缺失将导致小鼠毛囊干细胞动员加快,而对毛囊干细胞的数量没有显著影响。