脑出血是危害人类健康的重大威胁之一,具有高发病率、高死亡率、高致残率的特点,对人的生存质量损害极大。近年来,随着人们生活质量的提高,大量的心脑血管高危因素涌入,脑出血（Intracerebral hemorrhage,ICH）的发病率和死亡率逐年增高,约占全部脑卒中病例的三分之一,但其病理生理机制尚不清楚,且缺乏有效的治疗方法。目前多种药物的临床试验都没有取得较为满意的结果。神经干细胞（Neural stem cells,NSCs）是脑内一类具有自我更新、多向分化潜能的细胞,负责对神经系统的修复。据报道,神经干细胞激活后的增殖、分化和迁移可能是脑出血后主要内源性保护机制。然而,由于缺乏对神经干细胞的认识和可操控性,以及其有限的修复能力,至今未能发挥巨大的作用。新近研究及发育生物学表明,在神经元损伤后的发育和修复过程中,存在一种内生的生物电磁场,帮助神经干细胞的修复。不同的电磁场特性,在时空上的差异,可能会对神经干细胞产生不同的影响,特别是对其增殖、分化和迁移的影响。重复性经颅磁刺激（repetitive Transcranial Magnetic Stimulation,rTMS）是目前临床用于神经系统治疗的主要外源性电磁场来源,其被广泛应用于神经疾病,是一种无创地穿透头皮,对神经细胞施加局部电磁场的物理方法。虽然这种无创治疗在多种疾病中治疗效果是确实的,但自1985年rTMS发明以来,很少有研究关注rTMS对ICH中NSCs的影响。新近研究显示,rTMS可以促进缺血大鼠神经干细胞的增殖。然而,目前还没有ICH模型下rTMS对神经干细胞的影响及其内在机制的研究,本研究旨在探讨rTMS对小鼠ICH模型神经功能、脑水肿、胶质细胞聚集以及神经干细胞迁移、增殖和分化的作用,并初步探讨了rTMS对NSCs作用的内在机制。本研究主要结果及结论如下:1.脑出血后小鼠内源性神经干细胞生物学特征（1）ICH后脑水含量及神经功能为了证明ICH动物模型是否符合标准,我们首先评估了神经功能缺损。术后0 h、24 h、72 h和120 h采用单盲法进行评估。结果显示,与假手术组相比,ICH组在各时间点都出现了严重的神经行为缺陷（p<0.05）。脑水肿被认为是评估脑损伤和炎症严重程度的主要病理特征之一。使用脑水含量测定来定量术后24 h、72 h和120 h大脑各部位脑水含量的百分比变化。与假手术组相比,ICH组仅同侧基底节（ipislateral Basal Ganglia,ips-BG）和大脑皮层（ipsilateral Cortex,ips-CX）的含水量增加（p<0.05）。与已有的研究一致,这些结果表明,脑出血损伤诱发了炎症反应,增加了脑含水量。（2）ICH后损伤周围NSCs增殖情况Ki-67蛋白（也称为mki67）是一种细胞增殖的标记物。细胞间期,Ki-67抗原特异出现在细胞核内,因此,Ki-67免疫荧光标记可用于评估NSCs的增殖情况。结果与已有研究结果一致:免疫荧光染色显示,ICH后72 h,血肿周围（基底节）Nestin阳性细胞中Ki-67阳性细胞的百分比显著增加,提示ICH激活NSCs增殖和迁移修复,显示出脑出血后机体自然的保护和修复机制。（3）ICH后损伤周围NSCs分化情况ICH的预后主要取决于功能神经元的再生情况,这些神经元重建了中枢神经系统中细胞间的功能连接;但正常病理过程下,内源性NSCs修复以胶质疤痕的产生为主,导致无效的功能恢复以及多种并发症。双皮质蛋白（doublecortin,DCX）是一种由胚胎、成人皮质中神经元前体细胞和未成熟神经元表达的微管相关蛋白。神经元前体细胞在活跃分裂的同时开始表达DCX,并随着细胞成熟为神经元,其神经元子细胞继续表达DCX 2-3周。结果表明,DCX阳性细胞在ICH后少量出现（P<0.022）,神经胶质细胞聚集是脑损伤后中枢神经系统炎症反应特征性表现。胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）是一种中间丝蛋白,由中枢神经系统的许多细胞类型,特别是神经胶质细胞表达。采用免疫荧光标记法检测ICH后炎性胶质细胞。结果与此前一致,ICH后72 h,GFAP阳性细胞数量在血肿周围显著增加（P<0.05）。上述结果提示ICH出现炎症性胶质细胞的聚集且尽管NSCs有部分神经元性分化来尝试修复神经功能连接,但NSCs分化仍以修复性胶质细胞为主。2.rTMS调控内源性神经干细胞修复脑出血损伤作用研究（1）脑水含量及神经功能为了确定rTMS是否在ICH修复中发挥重要作用,我们首先在术后0 h、24 h、72 h和120 h采用单盲法评估了ICH后的神经功能。经1、2、3次处理后,rTMS处理改善了ICH小鼠的神经功能（24 h:ICH组,7.47±0.35 vs.ICH/rTMS组,9.00±0.45,p=0.012,F因子=232.8;72 h:ICH组,3.67±0.40 vs.ICH/rTMS组,6.67±0.53,p=0.0001,F因子=325.0;120 h:ICH组,12.07±0.51 vs.ICH/rTMS组,13.87±0.62,p=0.034,F因子=31.35）且小鼠在ICH后第三天的神经功能改善最明显。术后24 h、72 h和120 h,用脑水含量测定定量各部位脑含水量的百分比变化。经1、2、3次治疗后,rTMS治疗缓解了脑肿胀程度（ips-BG:24 h,ICH组80.44±0.26%vs.ICH/rTMS组79.08±0.42%,p=0.010,F因子=16.38;72 h:ICH组81.87±0.22%vs.ICH/rTMS组79.82±0.35%,p<0.0001,F因子=63.04;120 h:ICH组80.96±0.20 vs.ICH/rTMS组79.61±0.79%,p=0.0023,F因子=40.06;ips-CX:24 h,ICH组,80.39±0.25%vs ICH/rTMS组,79.34±0.27%,p=0.0083,F因子=19.34;72 h:ICH组,80.48±0.23%vs ICH/rTMS组,79.71±0.29%,p=0.044,F因子=22.73;120 h:ICH组,80.23±0.18%vs ICH/rTMS组,79.43±0.31%,p=0.034,F因子=13.75）与神经功能评分结果一致,小鼠术后第三天脑水含量降低幅度最大。这些结果提示rTMS可减少脑出血后的脑含水量和神经功能缺损。（2）内源性NSCs增殖采用Ki-67免疫荧光标记法评价NSCs的增殖情况,结果表明,ICH/rTMS组经72 h rTMS处理后,其血肿周围NSCs增殖率较ICH组增加近46%。（53.8±6.9 vs.78.8±7.6,p=0.041）,表明rTMS增强了内源性NSCs的增殖。（3）内源性NSCs神经元性分化rTMS治疗对ICH的恢复是否起到重要作用,主要取决于其是否能影响修复过程中NSCs的终末分化方向。使用DCX免疫荧光标记来确定rTMS治疗是否能促进ICH后神经元性修复即有效修复。结果表明,DCX阳性细胞在rTMS处理后较ICH组明显增加约72%（176.4±21.8 vs.304.2±39.4,p=0.022）,这些结果提示rTMS具有引导内源性NSCs向神经元分化的积极作用（重建神经功能）。（4）胶质细胞聚集采用免疫荧光标记法检测ICH后炎性胶质细胞。结果表明,72 h rTMS处理后,GFAP阳性细胞明显减少约41%（267.6±26.5 vs.156.2±20.3,p=0.010）,提示rTMS降低了ICH后胶质细胞聚集。3.rTMS调控离体神经干细胞生物学行为作用研究（1）体外NSCs增殖经rTMS处理后,在光学显微镜下观察神经球,显示rTMS暴露后神经球直径显著增加83%（67.6±18.3 vs.124.2±11.5,p=0.031）。性别决定域Y-框2（sex-determining region Y-box 2,SRY-box2）也被称为Sox2,是一种转录因子,对维持未分化胚胎干细胞的自我更新或多能性至关重要,同样在维持胚胎和神经干细胞方面也起着关键作用。本实验采用SOX2和Ki-67免疫荧光共标法检测NSCs体外增殖情况。结果显示,与对照组相比,每个神经球的SOx2阳性细胞数量（117%,283.0±69.6 vs.615.4±98.0,p=0.024）和Ki-67阳性细胞百分比显著增加。（58%,32.2±3.6 vs.51.0±5.6,p=0.022）,这表明rTMS可以在体外促进NSCs增殖。（2）体外NSCs分化神经元和胶质细胞是神经干细胞的两种最主要的分化类型,也是神经中枢系统的主要细胞。这些细胞参与了ICH的恢复,在此过程中起着关键作用。总之,神经元和胶质细胞分布配比决定了脑出血的最终结局。在光学显微镜下,与对照组相比,rTMS组NSCs很少表现出粘附性,分支较少。基于这一现象,对NSCs的代表性标记DCX和GFAP进行共染,检测NSCs在体外的分化情况。共聚焦成像显示,与对照组相比,rTMS组神经球的DCX百分比显著增加（360%,18.4±8.9 vs.84.6±7.2,p=0.0004）;GFAP显著降低（82%,14.4±2.7 vs.5.6±1.9,p=0.028）,表明rTMS可以在体外调节NSCs的分化方向。4.rTMS调控内源性神经干细胞作用机制研究（1）rTMS相关通路的相互作用网络分析使用GCBI在线平台,微阵列数据分析根据国际标准（p<0.05,q<0.05,倍数变化>1.5）分析对照组及处理组之间转录组的差异。包括rTMS引起显著改变的基因、细胞功能及主要的信号通路。细胞功能分析结果表明,rTMS治疗后,DNA依赖的转录调控（排名1）、DNA依赖转录（排名2）、细胞周期（排名3）和细胞分裂（排名5）、磷酸化（排名12）、磷酸化蛋白（排名13）、神经系统发育（排名16）和离子转运（排名20）发生了变化。基于KEGG数据库,通路网络分析结果显示发生显著变化的几个主要信号通路及其之间的关系,包括MAPK信号通路、钙信号通路、TGFβ信号通路和轴突引导与神经发生显著相关。其中,钙信号通路、TGFβ信号通路和轴突引导已被认为与通过MAPK信号通路的神经发生密切相关。与这些显著改变的途径有关的基因（MAPK信号途径、钙信号途径、TGFβ信号途径、轴突导向）结果提示MAPK信号途径、钙信号途径、TGFβ信号途径、轴突导向可能是其中的潜在机制。（2）MAPK经典分子磷酸化水平根据生物信息学分析结果,我们对其中最关键的通路,MAPK信号通路进行了初步的探究,从经典的MAPK家族（Erk1/2,JNK/SAPK,p38）及其磷酸化水平入手,利用蛋白质印迹分析进行了观察。结果表明,rTMS处理后,P-Erk1/2和P-p38的表达水平增加。处理结束后,p-JNK/SAPK、JNK/SAPK、Erk1/2和p38的表达水平均无明显变化,但表达水平呈时间依赖性下降。另外,Erk1/2的特异性抑制剂sch772984和p38的特异性抑制剂sb203580可以阻断rTMS对Erk1/2和p38的磷酸化促进作用。即rTMS可以促进Erk1/2和p38的磷酸化增加,增强MAPK信号通路,提示MAPK信号通路是rTMS作用机制的主要的下游和中枢信号通路。（3）胞内钙离子浓度鉴于物理手段与MAPK信号通路之间的跨度较大,结合高通量数据分析结果,我们认为Ca²⁺是可能的起始因素。为了证明这一点,使用钙成像对胞内Ca²⁺水平进行定量。结果表明,rTMS处理后胞内Ca²⁺水平升高,而电压门控Ca²⁺通道抑制剂硝苯地平可阻断rTMS这一作用,提示直接受电磁场调控的Ca²⁺可能是该过程的始动因素。综上所述,我们的研究结果证实,rTMS是一种无创、安全、方便、疗效肯定的治疗实验性脑出血的工具,通过增强神经干细胞的神经发生,引导神经细胞分化,抑制胶质细胞性分化和聚集,这些现象的机制可能与通过MAPK信号通路实现神经发生、炎症反应、胶质细胞重新编程和轴突引导有关。