目的:肌肉减少症是一种以骨骼肌质量和力量进行性和普遍性丧失为特征的综合症,受衰老、肥胖、炎症、营养不良等多种因素的影响。肥胖作为全球流行的慢性疾病,与心血管疾病、胰岛素抵抗和癌症的风险增加有关,而骨骼肌作为体内最大的新陈代谢调节剂,其功能和质量均会受到肥胖的负面影响。关于肥胖和肌少症的研究,大多是将脂肪组织和肌肉组织作为两个彼此独立又相互联系的器官,脂肪组织作为分泌细胞因子的器官,可以减少瘦素、脂联素、网膜素等因子的表达,促进IL-6,TNF-α,IFN-γ等炎症因子分泌,而骨骼肌作为接收细胞因子的效应器官,出现氧化应激增强、线粒体功能障碍、胰岛素抵抗等现象,最终损害肌肉功能和质量。肥胖时过多的脂肪会异位沉积在肌肉、肝脏、内脏器官等组织中,产生脂毒性效应。因此,除外脂肪组织和肌肉组织之间通过各种分泌因子产生的Cross talk外,脂肪在肌肉组织中的异位沉积通过何种机制直接影响肌少症的发生值得研究。Nur77,又叫做核受体亚家族4A1（nuclear receptor subfamily 4A1,NR4A1）,既是转录调节剂,也是脂毒性传感器。有研究发现,肥胖男性骨骼肌组织、高脂饮食小鼠的肝脏和肌肉组织中Nur77蛋白水平下降,Nur77缺失会加剧颈动脉、肝脏以及骨骼肌中的脂质沉积,而且Nur77缺失小鼠体脂含量增加。此外,相关研究表明Nur77也是小鼠肌肉生长的调节剂。Nur77基因敲除的成年小鼠其肌肉质量和肌纤维横截面积均明显减少,而小鼠骨骼肌中Nur77过表达导致肌纤维横截面积增加,其具体机制为Nur77可通过促进IGF-1的表达,激活Akt/m TOR/p70S6K信号通路的,促进蛋白质合成。同时Nur77下调生长受限基因,如肌生成抑制素Myostain的表达,也可通过抑制炎症因子NF-κB的表达,最终下调骨骼肌特异性E3泛素蛋白酶Mu RF1和MAFbx的表达减少骨骼肌蛋白质降解。因此,Nur77可能是肥胖导致肌少症发生的关键靶点。目前针对肌少症的机制研究主要集中在成肌细胞中蛋白质合成和降解之间的动态平衡被破坏。而肌细胞的蛋白质合成和降解代谢的过程并非彼此独立,主要受IGF-1/PI3K/Akt通路及其下游信号因子的调控,包括Akt/m TOR/p70S6K蛋白质合成相关通路,以及FOXOs/MAFbx/Mu RF1蛋白质降解相关通路,其中MAFbx/Mu RF1通路受到Akt的负调控。PTEN作为PI3K-Akt信号通路的抑制因子,参与许多细胞生理过程,包括能量代谢、增殖、存活、迁移和基因组稳定性。许多研究发现,HFD喂养小鼠的肝脏、脑、肌肉组织中,PTEN蛋白表达升高伴随Akt-m TOR信号传导的抑制,而且HFD喂养小鼠肌肉组织中PTEN蛋白的高表达损害了再生肌纤维的生长以及肌肉卫星细胞的增殖。肌肉特异性敲除PTEN促进了高脂饮食小鼠的肌肉细胞生长。那么在肥胖机体中,Nur77能否通过调控PTEN影响肌肉蛋白质合成与降解,进而参与肌少症的发生有待研究。本研究以WT和Nur77-/-的HFD模型肥胖小鼠、Nur77过表达以及敲低的C2C12成肌细胞为研究对象,通过体内实验研究Nur77对肥胖性肌少症的影响以及在体外观察Nur77对PTEN信号通路和肌细胞蛋白质合成与降解的影响,阐明Nur77参与调控肥胖性肌少症的具体机制。方法:第一部分:肥胖通过破坏蛋白质合成与降解的平衡导致肌少症的发生1.WT小鼠分别给予ND或HFD喂养8W、16W和24W,构建肥胖模型。定期记录小鼠体重变化,并检测小鼠体成分、血清和腓肠肌组织中TC、TG含量。2.检测小鼠抓力和运动能力,取材腓肠肌组织并称重。腓肠肌组织切片H＆E染色观察肌纤维横截面积,腓肠肌组织切片油红O染色观察肌肉中脂肪浸润情况。3.WB检测小鼠肌肉组织Nur77蛋白水平和蛋白质合成与降解相关分子表达变化。第二部分:Nur77通过调控蛋白质合成与降解参与肥胖性肌少症的发生1.WT和Nur77-/-小鼠分别给予ND或HFD喂养24W构建肥胖模型。定期记录小鼠体重变化,并检测小鼠体成分、血清和腓肠肌组织中TC、TG含量。2.检测小鼠抓力和运动能力,取材腓肠肌组织并称重。腓肠肌组织切片H＆E染色观察肌纤维横截面积,腓肠肌组织切片油红O染色观察肌肉中脂肪浸润情况。3.WB检测小鼠肌肉组织中蛋白质合成与降解相关分子表达变化。4.PA处理C2C12细胞检测Nur77蛋白水平以及IF观察肌管萎缩情况。5.C2C12细胞中过表达或敲低Nur77的同时给予PA处理,WB检测蛋白质合成与降解相关分子表达变化。第三部分:Nur77通过促进PTEN泛素化降解调控肌肉蛋白质合成与降解1.WB检测小鼠肌肉组织中PTEN蛋白变化以及在C2C12细胞中过表达和敲低Nur77后检测PTEN蛋白变化。2.在C2C12细胞中敲低Nur77的同时给予PTEN特异性抑制剂SF1670,WB检测蛋白质合成与降解相关分子表达变化。3.在C2C12细胞中过表达和敲低Nur77后检测PTEN的m RNA变化,给予蛋白酶抑制剂MG132或蛋白质合成抑制剂CHX后,WB检测PTEN蛋白变化。4.WB检测小鼠肌肉组织中Syvn1蛋白变化以及在C2C12细胞中过表达和敲低Nur77后检测Syvn1的m RNA变化。此外,过表达Nur77同时敲低Syvn1检测PTEN蛋白变化。5.Co-IP实验检测Syvn1与PTEN之间是否存在蛋白质相互作用,以及过表达Nur77同时敲低Syvn1检测PTEN蛋白泛素化水平。6.Ch IP-q PCR和双荧光素酶报告实验验证Nur77是否和Syvn1启动子结合促进其转录。结果:第一部分:肥胖通过破坏蛋白质合成与降解的平衡导致肌少症的发生1.随着高脂饮食喂养时间延长,小鼠体脂率逐渐升高,瘦重含量逐渐下降,肌肉中脂肪浸润逐渐加重。2.高脂饮食喂养小鼠出现肌少症表现,随着高脂饮食喂养时间延长,小鼠抓力、运动能力逐渐下降,肌纤维横截面积逐渐减少,肌少症程度逐渐加重。3.高脂饮食小鼠肌肉组织中蛋白质合成分子Akt/m TOR/p70S6K表达下降,蛋白质降解相关分子MAFbx、Mu RF1表达升高。4.小鼠肌肉组织中Nur77蛋白水平随高脂饮食时间的延长而逐渐下降。第二部分:Nur77通过调控蛋白质合成与降解参与肥胖性肌少症的发生1.Nur77缺失加剧小鼠体脂率升高,瘦重含量下降,肌肉中脂肪浸润程度更加严重。2.Nur77缺失导致小鼠抓力、运动能力明显下降,肌纤维横截面积显著减少,肌少症程度更加严重。3.Nur77缺失导致小鼠肌肉组织中蛋白质合成分子Akt/m TOR/p70S6K表达下降,蛋白质降解相关分子MAFbx、Mu RF1表达升高。4.PA处理C2C12细胞导致Nur77蛋白水平下降,而且肌管发生明显萎缩,肌细胞蛋白质合成分子Akt/m TOR/p70S6K表达下降,蛋白质降解相关分子MAFbx、Mu RF1表达升高。5.过表达Nur77可以部分恢复PA导致的肌管萎缩,而且可以促进蛋白质合成分子Akt/m TOR/p70S6K表达,抑制蛋白质降解相关分子MAFbx、Mu RF1表达。第三部分:Nur77通过促进PTEN泛素化降解调控肌肉蛋白质合成与降解1.高脂饮食以及Nur77缺失均会导致小鼠肌肉组织中PTEN蛋白水平升高。C2C12细胞过表达和敲低Nur77可以负向调控PTEN蛋白变化。2.解除PTEN蛋白对Akt磷酸化的抑制后,肌细胞蛋白质合成分子Akt/m TOR/p70S6K表达升高,蛋白质降解相关分子MAFbx、Mu RF1表达下降。3.Nur77并不影响PTEN的转录水平,但是可以促进PTEN泛素化降解。4.Nur77通过转录调控E3酶Syvn1的表达加速PTEN泛素化降解。结论:第一部分:肥胖通过破坏蛋白质合成与降解的平衡导致肌少症的发生1.肥胖通过破坏蛋白质合成与降解的平衡导致肌少症的发生。2.持续肥胖导致肌肉组织中Nur77蛋白水平逐渐下降。第二部分:Nur77通过调控蛋白质合成与降解参与肥胖性肌少症的发生1.Nur77缺失加重小鼠肥胖性肌少症的发生。2.Nur77通过促进蛋白质合成以及抑制蛋白质降解参与肥胖性肌少症的发生。第三部分:Nur77通过促进PTEN泛素化降解调控肌肉蛋白质合成与降解1.Nur77可通过加速PTEN泛素化降解激活下游蛋白质合成并抑制蛋白质降解。2.Nur77可通过转录调控E3酶Syvn1的表达促进PTEN的泛素化降解。