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目前市面上治疗中枢神经系统类疾病的药物,都需要跨越血脑屏障(Blood Brain Barrier,BBB)的障碍,然而,大部分的药物不能穿越血脑屏障。目前蛋白质类药物因其低毒性,靶向性,高效性而备受关注。本研究拟模拟霍乱毒素(Cholerla Toxin,CT)的分子结构,构建一种脑靶向性的递药载体,该递药载体将能克服血脑屏障的障碍,高效无创地将药物输送入脑部。天然的霍乱毒素由B亚单位(Cholerla Toxin B Subunit,CTB)和A亚单位(Cholerla Toxin A Subunit,CTA)组成。五聚体(CTB)5能够与神经结苷脂(GMI (Gangliosidoses GM1)结合,而A亚单位则“插”在五聚体中间的小孔上。B亚单位通过与粘膜表面的GM1结合,使得整个CT分子瞄定在粘膜表面上,引导A亚单位经由中间小孔,进入细胞。进入细胞后,A亚单位迅速被水解为A1与A2部分。A1部分为毒性部分可使得细胞内离子外输,而威胁生命。A2则为无毒部分,是与(CTB)5“小孔”作用的关键部分。本研究致力于寻找一种方法,构建一种类似霍乱毒素结构的递药载体,可协助蛋白质药物的跨血脑屏障运输,可用EGFP作为示踪蛋白,(CTB)5可与鼻粘膜上富含的神经结苷脂GM1结合,引导EGFP-CTA2无创进入体内。为了提升EGFP-CTA2的跨膜能力,有效将EGFP输送入大脑内,还将一短肽TAT(HIV反式激活因子)与之融合,最终获得一种新型递药载体蛋白“EGFP-CTA2-TAT/(CTB)5".本研究经探索,使用体外组装获的方法来获得目标蛋白EGFP-CTA2-TAT/(CTB)5.首先,将CTB克隆到pETduet-1多克隆位点1上,经过IPTG诱导表达,条件优化为0.75mmol/LIPTG、160r/mim、37℃、表达6h后,可以获得大量的包涵体蛋白CTB,经过洗涤,纯化,复性获得蛋白(CTB)5。使用本实验室保存的pET22b-EGFP-CTA2-TAT进行上清表达及纯化EGFP-CTA2-TAT,优化EGFP-CTA2-TAT诱导表达条件为0.1mmol/L IPTG,28℃,诱导表达8h后,可获得上清EGFP-CTA2-TAT的表达量最大。经NI-NTA纯化后得蛋白EGFP-CTA2-TAT。(CTB)5与EGFP-CTA2-TAT经过超滤除盐,按(CTB)5:EGFP-CTA2-TAT为5：1的摩尔比混合蛋白,并对混合物经酸变性,碱复性后,利用HPLC和非变性电泳鉴定六聚体蛋白EGFP-CTA2-TAT/(CTB)5的形成。GMl-ELISA实验验证目的蛋白与GM1的结合活性。使用荧光直接观察判断目的蛋白仍保留EGFP的绿色荧光。通过PC-3细胞的体外穿膜实验,表明六聚体蛋白依然保持高效的穿膜能力。