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目的:世界卫生组织预测,不孕不育将成为仅次于肿瘤和心血管疾病的第三大疾病。其中,男性因素约占不孕不育的50%,并且出现逐年增加的趋势。弱精子症是最常见的男性不育症类型,约70%的不育男性患有弱精子症,至今对其发病机制尚未能确切的阐明,目前普遍认为,基因调控异常是弱精子症发病的中心环节。近年来,微小RNA(microRNA,miRNA)功能的研究正在不断深入,在男性不育研究领域,研究者们一致认为,mi RNA通过调控其特异的靶基因转录和翻译而影响精子发生过程。目前已知miR-let7家族能调控精原干细胞增殖和发育,在精子运动、获能、受精和胚胎发育中参与重要作用。细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子1A(cyclin-depedent kinase inhibitors 1A,CDKN1A)是细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子(CDKI)家族成员之一,是细胞周期重要的调控因子。本研究以mi R-let-7c为研究对象,构建miR-let-7c过表达和沉默表达慢病毒载体感染小鼠精原细胞株GC-1spg,通过在线预测软件预测mi R-let-7c的下游靶基因为CDKN1A,在体外细胞水平探讨miR-let-7c对精原细胞增殖作用、CDKN1A基因和蛋白表达的影响,从而探讨mi R-let-7c对精子发生的作用机理及其参与弱精子症发病机制的研究。方法:1、应用慢病毒载体构建慢病毒转染细胞:分别构建含有过表达mi R-let-7c慢病毒载体、沉默表达mi R-let-7c慢病毒载体及空载体对照慢病毒感染小鼠精原细胞GC-1spg。将GC-1spg细胞按照不同处理方法分为:转染空载慢病毒的阴性对照组、转染miR-let-7c过表达慢病毒的miR-let-7c上调组(GV309-Pre-miR-let-7c mimics)、转染miR-let-7c沉默表达的mi R-let-7c下调组(GV280-Pre-mi R-let-7c inhibitor)和未转染慢病毒的空白对照组。转染8小时,继续培养72h后收集细胞,根据荧光显微镜观察转染效率。2、实验验证:通过生物信息学预测软件miRWalk2.0、TargetScan、mi Randa、miRDB对miR-let-7c可能调控的下游靶基因进行预测;通过CCK8实验检测GC-1spg细胞增殖情况;采用实时荧光定量PCR和Western Blotting检测阴性对照组、空白对照组、miR-let-7c上调组和miR-let-7c下调组细胞中CDKN1A基因和蛋白水平表达情况。结果:1、构建的miR-let-7c过表达和沉默表达慢病毒重组质粒载体,经测序后鉴定结果均与目标序列完全一致,包装的慢病毒滴度测定结果分别为3×10~8、6×10~8 TU/ml;2、在添加DMEM和Polybrene(5μg/mL)条件下,MOI值为80时慢病毒感染GC-1spg细胞8h,更换新鲜培养基72h后荧光显微镜下判断感染效率>95%;3、通过在线预测软件预测CDKN1A为miR-let-7c的下游靶基因;4、CCK8检测结果显示,与对照组相比,mi R-let-7c上调组的GC-1spg细胞生长速度减慢,细胞增殖明显受抑制(P<0.01);5、qRT-PCR与Western Blotting结果显示,与对照组比较,mi R-let-7c上调组CDKN1A mRNA和蛋白的表达下降,而mi R-let-7c下调组CDKN1A mRNA和蛋白相对高表达(P均<0.01)。结论:1、成功构建并包装了高滴度的miR-let-7c过表达和沉默表达慢病毒载体;2、成功建立慢病毒感染小鼠精原细胞GC-1spg的最优感染参数;3、miR-let-7c对小鼠精原细胞GC-1spg的增殖有抑制作用;4、miR-let-7c可负向调控小鼠精原细胞株GC-1spg中CDKN1A mRNA和蛋白表达。