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第一部分omega-3预处理对蛛网膜下腔出血后早期脑损伤的影响的实验研究目的研究omega-3预处理对蛛网膜下腔出血后早期脑损伤的影响。方法实验一:评估预处理(灌胃鱼油)大鼠脑组织中EPA和DHA的含量。1.动物分组:16只健康成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠随机分为4组(每组4只):对照组,安慰剂组,灌胃鱼油2周组,灌胃鱼油3周组。接受鱼油预处理的实验组采取每24小时灌胃一次鱼油(主要含30%omega-3),剂量为1g/kg体重。安慰剂组以同样的方法步骤接受等量的玉米油灌胃3周。2.提取脑组织,进行脂质萃取及气相色谱分析,分析脑组织中DHA和EPA的含量。实验二:研究鱼油预处理后对SAH后EBI病理过程的影响。1、动物分组:60只成年健康雄性SD大鼠,随机分为4组,每组12只。假手术组,SAH组,SAH+安慰剂组,SAH+鱼油2周组。2、动物模型制作:实验性蛛网膜下腔出血动物模型采用视交叉前池注血法。24小时后处死大鼠,灌注取脑并且留取颞底脑标本检查。3、检测方法及指标:干湿重法测定各组大鼠脑水肿指数,TUNEL和FJB评估各组大鼠蛛网膜下腔出血后脑组织中细胞凋亡和神经元退变,Western blot检测各组大鼠脑组织中COX-2、MCP-1和i NOS的蛋白表达。结果1、鱼油喂养2周和3周均可明显升高脑组织中DHA和EPA的含量(p<0.05);鱼油喂养2周组和鱼油喂养3周组相比,DHA和EPA的含量无显著差异(p<0.05)。2、蛛网膜下腔出血24小时后脑水肿明显(p<0.05),而鱼油预处理可减轻蛛网膜下腔出血后脑水肿(p<0.05)。3、蛛网膜下腔出血后24小时候脑组织中TUNEL和FJB阳性细胞数明显增加(P<0.01),鱼油预处理可显著减少TUNEL和FJB阳性细胞(P<0.05)。4、COX-2,MCP-1和iNOS的蛋白表达在SAH组中显著升高(P<0.01);鱼油预处理则可显著下调COX-2,MCP-1和iNOS的蛋白表达(P<0.05)。结论1、鱼油喂养可以有效地上调大鼠脑组织中DHA和EPA的含量,鱼油喂养2周即可达到最佳效果,在喂养2周的基础上延长1周喂养不能明显进一步升高大鼠脑组织中DHA和EPA的含量。2、鱼油喂养预处理后脑细胞死亡和神经元退化显著减轻,脑组织中炎性因子的表达明显减少。第二部分omega-3预处理抑制SAH后EBI的作用机制的实验研究目的探讨omega-3预处理对SAH后早期脑损伤的可能作用机制。方法1、动物分组:60只成年健康雄性SD大鼠,随机分为4组,每组12只。假手术组,SAH组,SAH+安慰剂组,SAH+鱼油2周组。2、动物模型制作:实验性蛛网膜下腔出血动物模型采用视交叉前池注血法。24小时后处死大鼠,灌注取脑并且留取颞底脑标本检查。3、检测方法及指标:SAH建模24h后,对大鼠进行行为学评分,然后处死大鼠并取材。western blot检测GPR120在各组脑组织中的蛋白水平以及各组大鼠脑组织内TAK1,MEK4,JNK和IKK磷酸化水平。IP检测各组大鼠脑组织中GPR120/β-arrestin2结合、β-arrestin2/TAB1的结合以及TAK1/TAB1结合能力。EMSA检测各组大鼠脑组织中NF-κB活性。结果1、SAH后脑组织中GPR120的蛋白表达明显下降(P<0.01);而omega-3预处理能够抑制SAH引起的GPR120蛋白水平的降低(P<0.01)。2、omega-3预处理可以显著增强GPR120与β-arrestin2以及β-arrestin2与TAK1的结合,并抑制TAK1与TAB1的结合(P<0.05)。3、SAH后脑组织中TAK1,MEK4,JNK和IKK的磷酸化水平显著增加,而omega-3预处理可以显著抑制这些蛋白的磷酸化(P<0.05)。4、经过omega-3预处理,SAH引起的NF-κB的活化被显著抑制(P<0.05)。结论omega-3预处理可能通过GPR120/β-arrestin2/TAB1/TAK1信号通路抑制SAH后脑组织中MEK4,JNK和IKK的磷酸化和NF-κB的活化,从而抑制SAH后的免疫炎症反应。第三部分omega-3以GPR120依赖的方式减轻蛛网膜下腔出血后早期脑损伤目的进一步研究GPR120在omega-3影响SAH后EBI的β-arrestin2/TAB1/TAK1信号通路中的作用方法1.实验动物分组:将24只SD大鼠随机分为3组。SAH+omega-3组,SAH+omega-3+Ctr siRNA GPR120组,SAH+omega-3+siRNA GPR120组。2.各组大鼠在建立SAH模型前接受2周的鱼油灌胃。除SAH+omega-3组外,在建立SAH模型前48h分别接受si RNA或Ctr siRNA转染。应用视交叉前池注血法建立实验性蛛网膜下腔出血动物模型。24h后处死大鼠、灌注取脑并留取颞底脑组织标本进行相关检查。3.检测指标:免疫荧光染色GPR120检测各组大鼠脑细胞凋亡。western blot检测各组脑组织中GPR120的蛋白表达水平以及各组大鼠脑组织内TAK1,MEK4,JNK和IKK磷酸化水平。TUNEL检测脑细胞死亡,FJB检测神经元退化。IP检测各组大鼠脑组织中β-arrestin2/TAB1以及TAK1/TAB1结合能力。EMSA检测各组大鼠脑组织中NF-κB活性。Western blot检测各组脑组织中免疫炎症因子COX-2,MCP-1和iNOS的蛋白水平。结果1、在SAH+omega-3 fatty acids条件下,GPR120siRNA体内转染显著抑制大鼠脑组织内GPR120的蛋白表达(p<0.001)。2、GPR120干扰使omega-3 fatty acids预处理促进β-arrestin2/TAB1结合的作用下降(p=0.003),抑制TAK1/TAB1结合的作用减弱(p=0.033)。3、GPR120干扰减弱了omega-3fatty acids预处理抑制TAK1,MEK4,JNK和IKK磷酸化的作用(P<0.05),减弱了抑制NF-κB活性的作用(p=0.015)。4、GPR120干扰减弱了omega-3 fatty acids预处理抑制脑细胞死亡的作用(p=0.017),减弱了抑制神经元退化的作用(p=0.041)。5、GPR120干扰减弱了omega-3 fatty acids预处理抑制炎症反应的作用(p<0.05)。结论1、omega-3可以通过其受体GPR120促进β-arrestin2/TAB1相互作用而竞争性抑制TAB1和TAK1的相互作用,进而抑制JNK和NF-κB通路以及脑细胞死亡和免疫炎症反应。GPR120siRNA体内转染可以有效地发挥其干扰作用。2、omega-3以GPR120依赖的方式减轻SAH后EBI。3、GPR120在β-arrestin2/TAB1/TAK1信号通路中的关键地位可能使其成为治疗SAH的新靶点。