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喹赛多是喹噁啉类新品种药物,具有明显的抗菌促生长作用,又兼具毒副作用小、安全性高、用药吸收快、消除迅速、无蓄积残留等优点。为了能够更好地推广喹赛多的注册使用,本实验室对其药理作用进行了大量的研究。前期研究发现喹赛多在体内外均能够上调GH表达水平,并以GH3细胞为模型,通过基因组和蛋白组的分析方法,筛选到了大量的差异基因和差异蛋白。其中喹赛多孵育细胞1h后的基因芯片结果显示,共有15个差异基因,早期生长反应因子1(early growth response factor 1,Egr1)的上调倍数最大。Egr1为锌指结构转录因子,属于即刻早期反应基因,能够调控细胞内多个靶基因的表达。因此,推测Egr1在喹赛多药理作用的发挥中扮演重要角色。此外,大量研究表明喹赛多能够上调GH的合成,但是喹赛多是通过哪些信号通路来调控GH基因的表达,Egr1是否参与喹赛多上调GHmRNA表达的过程,目前还不清楚,这也是本课题所要研究的问题。1.GH3细胞中喹赛多调控GH表达的信号通路的确定为确定喹赛多调控GH3细胞中GH表达的信号通路,本研究选择了 7种信号通路抑制剂,采用实时荧光定量PCR的实验方法,在药物(2μM)孵育1h后,运用相对定量分析方法,检测各个抑制剂处理组和药物共处理组中GHmRNA表达水平的变化。发现加入抑制剂 AG490、LY294002、PD98059、FTS、MDL-12,330A、H89 后,共处理组中GHmRNA水平显著下调,由此确定AC/PKA、Jak/PI3K、Ras/ERK这三条信号通路为喹赛多调控GH合成的调控路径,其中,AC/PKA、ERK信号通路的作用最为明显。2.喹赛多调控Egr1表达的时效关系和信号通路的确定为了确定喹赛多调控Egr1表达的上游信号通路是否为ERK信号转导通路,本研究首先以2μM喹赛多与GH3细胞进行孵育,孵育时间分别为0.5h、1h、2h、4h和8h,然后运用实时荧光定量PCR相对分析方法,检测不同处理组Egr1 mRNA表达水平的变化,结果显示孵育1h时细胞中Egr1 mRNA的表达量最高,因此确定药物与细胞孵育的最佳时间为1h;然后,选用PD98059(20μM)预处理细胞1h,加入喹赛多处理1h,检测Egr1 mRNA表达水平,发现PD98059能够显著抵消喹赛多对Egr1的上调作用,由此确定喹赛多调控Egr1的通路为ERK信号转导通路。3.Egr1-siRNA转染GH3细胞条件的确定为了深入研究Egr1的功能作用,本研究采用RNA干扰实验技术使Egr1沉默表达。选用脂质体2000将自身带有荧光标记的FAM-siRNA转染入GH3细胞,观察荧光分布状态,判断转染效率。确定转染试剂的用量后,利用阴性阳性对照siRNA优化转染条件,通过分别检测内参基因和靶基因的表达水平,发现40pmol和60pmol的siRNA剂量均能满足实验要求。最后,分别将三条甲基化的Egr1-siRNA转染GH3细胞,分别采用实时荧光定量PCR和Western-Blot实验方法,检测转染后Egr1 mRNA和蛋白水平的变化,最终筛选出Olig01183siRNA符合实验要求,在剂量为40pmol时均能在基因水平和蛋白水平使Egr1沉默,由此确定40pmol Oligo 1183siRNA为RNA干扰所需的序列。4.Egr1在喹赛多上调GH表达中的功能分析通过RNA干扰技术使Egr1沉默表达成功后,分别检测喹赛多处理组中GH mRNA表达水平和CREB磷酸化水平变化,结果显示两者均极显著下调,说明Egr1参与调控GH的合成过程,并且能够下调CREB的磷酸化作用;同时,检测细胞中锌离子转运蛋白(solute carrier family 30,member1,Slc30a1)、蛋白特异性磷酸酶(dual specificity phosphatase 6,Dusp6)、金属硫蛋白(metallothionein 1a,Mt1a)、孤核受体(nuclear receptor subfamily 4,member 1,Nr4a1)的表达情况,发现干扰组 Dusp6 表达变化不显著,Mt1a下调表达,Nr4a1和Slc30a1均显著上调表达,而加入喹赛多后,Dusp6、Slc30a1和Mt1a下调表达,而Nr4a1仍然显著上调表达。说明Egr1与其他差异基因之间的调控关系比较复杂,其中,Nr4a1作为即刻早期反应基因,其转录可独立于Egr1的调控。综上所述,喹赛多孵育GH3细胞后,通过AC/PKA、Jak/PI3K、Ras/ERK这三条信号通路调控GH合成,通过ERK1/2调控Egr1的合成,并且,在喹赛多作用细胞初期,主要通过MAPK/ERK信号通路发挥药理作用,而Egr1通过调控CREB磷酸化进而调控GH合成,在喹赛多调控GH合成中起桥梁作用。对于Egr1与其他差异基因间的功能研究,发现Nr4a1与Egr1同为锌指结构转录因子,同为即刻早期反应基因,它们之间不存在上下游的调控方式,而Slc30a1和Mt1a与Egr1之间主要因为锌离子浓度变化存在相互调控的作用方式,Dusp6与Egr1之间主要是因为ERK信号通路的磷酸化状态存在一定的调控作用。本研究探讨了喹赛多调控GH合成的信号通路,完善了喹赛多在分子水平对GH合成的调控的机理研究;确定了喹赛多对Egr1的上游调控通路;重点分析了 Egr1在喹赛多调控GH合成中的作用,并首次确定了 Egr1通过对CREB磷酸化的调控来影响GH的合成,为今后有关Egr1与GH的研究提供了重要的理论依据,为系统阐明喹赛多的促生长机理提供重要的数据支持,也为喹赛多进一步的开发利用提供重要参考。