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链霉菌是一类介于细菌和真菌之间的原核微生物,它能够产生诸多抗肿瘤、抗病毒、抗糖尿病等生物活性代谢产物,受到科研人员持续关注。1-脱氧野尻霉素(1-deoxynojirimycin,DNJ)是一种亚胺糖多羟基哌啶生物碱,主要存在桑叶、鸭跖草等植物和芽孢杆菌、链霉菌等特定微生物中,因能抑制α-葡萄糖苷酶活性,在治疗糖尿病、艾滋病、肿瘤等疾病有潜在应用价值。由于植物源DNJ含量极低(桑叶为0.1341 mg/g干重,鸭跖草为0.1125 mg/g干重),成为其体内外活性评价、构效关系研究和工业化应用瓶颈,因而微生物源DNJ逐渐吸引研究人员注意。当前微生物源DNJ增产方法集中在菌种选育和发酵过程优化,缺乏对DNJ生物合成途径了解,极大限制基于合成途径信息调控产物产量研究。此外,作为高效α-葡萄糖苷酶抑制剂,DNJ能抑制多种α-葡萄糖苷酶(二糖酶、多糖酶)活力,其抑制机理的解析将有助于根据DNJ结构,合成和设计高效的α-葡萄糖苷酶抑制剂药物。淡紫灰链霉菌UN-8是课题组前期从自然生境分离的一株DNJ产生菌。本论文首先开展不同碳源及其浓度下DNJ产生菌UN-8的生理特性研究,挖掘该菌株其他性能;其次开展DNJ生物合成途径研究;之后根据已阐明的生物合成途径,针对性开发调控DNJ合成策略;最后从生物物理学角度揭示DNJ抑制不同α-葡萄糖苷酶(二糖酶麦芽糖酶、多糖酶葡萄糖淀粉酶)活力机制,主要结果如下:(1)UN-8生理特性研究表明,当固体培养基中葡萄糖或麦芽糖浓度为40 g/L时,UN-8的生长分别受到100%和70%的抑制,表现低葡萄糖浓度和低麦芽糖浓度耐受特性。UN-8可以琼脂为唯一碳源进行生长,在液体培养基中摇瓶发酵测得琼脂酶活为0.03 U/ml,它的产生不依赖NaCl的存在,与海洋琼脂降解微生物存在差异。UN-8能生长在不含氮源培养基中,从中克隆得到固氮基因nifU长度为462 bp,翻译的氨基酸序列与Streptomyces sp.NRRL S-104、Streptomyces sp.NRRL F-4428、Streptomyces sp.PCS3-D2固氮蛋白NifU相似性分别达到98%、98%、97%,表明UN-8具有潜在生物固氮能力。这些生理特性将为后续DNJ合成调控提供参考。(2)通过前体喂养、13C稳定性同位素标记-核磁共振、超高效液相色谱-质谱联用技术阐明UN-8中DNJ生物合成途径。结果表明葡萄糖是DNJ合成最佳前体,合成过程中葡萄糖碳骨架经历C2/C6环化反应,同时分离鉴定出2-氨基-2-脱氧-D-甘露醇(ADM)、野尻霉素(NJ)及其脱水物中间体。合成路线简述如下:前体葡萄糖首先经糖酵解途径生成果糖-6-磷酸,而后经氨基化生成ADM,ADM继续氧化成NJ中间态,同时中间态以C2-N-C6环化成环状NJ,最后进行脱水、氢化生成DNJ。此外,实验发现较高浓度葡萄糖(>5 g/L)不利于DNJ合成,随后对这一现象进行探索,结果表明葡萄糖对DNJ合成调控不是由于葡萄糖磷酸化过程导致,而是较高浓度葡萄糖使细胞代谢过程中菌体生长环境pH成酸性,胞内ATP含量较低,菌体过早进入衰亡期,从而抑制DNJ合成。(3)根据阐明的DNJ合成路径,针对性地通过添加代谢抑制剂、前体及中间体类似物等策略调控DNJ合成。结果表明莽草酸途径抑制剂乙二胺四乙酸二钠、甲羟戊酸途径抑制剂辛伐他汀、糖酵解途径抑制剂柠檬酸钠和碘乙酸,前体葡萄糖及中间体类似物山梨糖可促进DNJ合成。在此基础上,运用正交实验设计开发调控DNJ合成策略:在初始培养基中加入山梨糖和柠檬酸钠,浓度分别为1g/L和5 g/L,待发酵至20小时和26小时,再分别添加碘乙酸和葡萄糖至浓度分别为50 mg/L和7 g/L,在此策略下共发酵72小时,DNJ最高产量达到296.56 mg/L,较前期提高2.3倍,表明此调控策略有效。(4)运用酶抑制动力学和多光谱学技术揭示DNJ对酿酒酵母来源二糖酶麦芽糖酶的抑制机理。结果表明DNJ抑制麦芽糖酶活力成剂量依赖性特征,表现非竞争性抑制占主导地位的混合型抑制机理。DNJ对麦芽糖酶的荧光猝灭机制为动态猝灭,其通过氢键和疏水相互作用结合到麦芽糖酶活性中心,诱导麦芽糖酶构象发生变化,导致α-螺旋比例下降、β-折叠比例上升、水力半径减小。此外,通过分子对接可知DNJ结构中2-OH、3-OH、4-OH、6-OH和-NH基团的氢原子与活性中心附近氨基酸残基Asp68、Asp214、Asp68、Glu276和Asp349形成氢键,键长分别为4.6A、1.9A、6.0A、1.9A和1.8A,从而干扰底物和麦芽糖酶的结合,抑制麦芽糖酶活力。(5)研究了DNJ对黑曲霉来源多糖酶葡萄糖淀粉酶的抑制机理。结果表明DNJ抑制葡萄糖淀粉酶活力成剂量依赖性特征,表现竞争性抑制占主导地位的混合型抑制机理。DNJ对葡萄糖淀粉酶的荧光猝灭机制属于动态猝灭,结合力为疏水相互作用和氢键,DNJ结合后引起葡萄糖淀粉酶构象发生变化以及色氨酸残基周围亲水性增加,导致α-螺旋比例下降、β-折叠比例上升、水力半径减小。分子对接模型结果显示DNJ结合到葡萄糖淀粉酶催化结构域,并与结构域保守氨基酸残基Arg78、Asp79、Glu203、Glu424形成氢键,同时被Trp76、Leu201、Trp202、Leu343、Met422、Gln425、Ala445疏水性氨基酸包围。分子动力学模拟表明DNJ结合后葡萄糖淀粉酶催化结构域氨基酸残基比游离葡萄糖淀粉酶具有较低的均方根波动值,并且结合位点在模拟过程中保持刚性。