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人类活动对全球环境的影响越来越大,环境中重金属的污染日益严重。在南极地区,生物遭受高盐度、高辐射、低温、重金属等多种胁迫,导致活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)的积累。南极生物可以合成冷活性抗氧化酶,如超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutases,SOD)、谷胱甘肽还原酶(Glutathione Reductase,GR)、过氧化物酶(Peroxidase,POD)和过氧化氢酶(Catalase,CAT)等,以清除活性氧ROS损伤,从而达到对重金属的积累或解毒。本文以南极红酵母AN5(Rhodotorula mucilaginosa AN5)为研究对象,对SOD和GR基因进行克隆、生物信息学分析、重组蛋白的诱导表达、纯化、蛋白特征及重金属适应性分析,初步探讨这2种基因(蛋白)在酵母逆境适应性中的作用。(1)将来自南极酵母R.mucilaginosa AN5的新型超氧化物歧化酶基因克隆,测序,然后在大肠杆菌中表达,分析目的蛋白特征。结果如下:R.mucilaginosa AN5 SOD(命名为Rm Fe SOD)基因开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)全长为639 bp,编码212个氨基酸,预测分子量为23.52 kDa,理论等电点(isoelectric point,p I)为7.89。经凝胶过滤层析和SDS-PAGE分析,天然状态的Rm Fe SOD以同型二聚体形式存在。p H值1.0-9.0条件下,孵育1小时,重组Rm Fe SOD表现出良好的p H稳定性。50℃下孵育1小时,Rm FeSOD仍保持80%以上的活性,具有相对较高的热稳定性。通过1 mmol/L的金属离子处理,Zn2+、Cu2+、Mn2+和Fe3+能够促进酶活性,Mg2+抑制酶活性。蛋白Rm FeSOD对化合物PMSF、SDS、吐温-80、Triton X-100、DMSO、β-ME和尿素的耐受性相对较低,但对还原剂DTT表现出一定的耐受性。铜胁迫实验中,Rm Fe SOD重组大肠杆菌比非重组菌表现出更好的生长,这表明Rm Fe SOD可能在重金属的适应性中起重要作用。(2)将来自南极酵母R.mucilaginosa AN5的谷胱甘肽还原酶基因克隆,测序,然后在大肠杆菌中表达,分析目的蛋白特征。结果如下:R.mucilaginosa AN5 GR(命名为Rm GR)基因ORF全长为1500 bp,编码499个氨基酸,预测分子量为54.8 k Da,p I为6.07。重组Rm GR的最佳酶活p H和温度分别为p H 7.5和30℃。在p H值3.0-8.0条件下,孵育1小时,Rm GR表现出良好的p H稳定性。在40℃下孵育1小时,Rm GR仍保持60%以上的活性,具有相对较高的热稳定性。铜和镉胁迫实验中,Rm GR重组大肠杆菌比非重组菌表现出更好的生长,这表明Rm GR可能在重金属的适应性中起重要作用。