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猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)又名“蓝耳病”是危害世界养猪业的首要传染病之一。该病以皮肤耳朵发绀、妊娠母猪繁殖障碍、哺乳仔猪的高死亡率、各年龄段猪的呼吸障碍、持续性感染等为主要特征,其病原为猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)。PRRSV基因组为单股正链RNA病毒,能够编码6个结构蛋白和14个非结构蛋白(nsp)。nsp4具有3C样丝氨酸蛋白酶活性,能够切割前体多聚蛋白pp1a/pp1ab产生多个非结构蛋白(nsp3-12)。为了研究nsp4在PRRSV感染过程中的作用,本研究通过大肠杆菌表达系统获得纯化nsp4蛋白,免疫新西兰大白兔后制备了高效价的针对nsp4的兔多抗血清。另外,对nsp4的蛋白质组学也进行了研究,构建nsp4真核表达载体,转染293T细胞获得Pulldown产物,质谱分析后利用W estern blot、免疫共沉淀、激光共聚焦验证出nsp4与细胞蛋白Myosin IIb(MYH10)、S RCAP、TRIM28相互作用。主要的研究内容如下:1.PRRSV nsp4抗体制备与鉴定:将HP-PRRSV TA-12(GenBank登录号:HQ416720)nsp4的基因克隆到表达载体pET28a(+)上,获得重组表达质粒pET28a-nsp4,重组质粒在Trasseta(DE3)细胞中经IPT G诱导获得了高效表达,并获得可溶性的重组蛋白。利用镍离子亲和柱(Ni-NTA)纯化获得高纯度的重组蛋白nsp4。用纯化后的重组蛋白nsp4免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。ELISA检测抗体效价可达106,Western-blot和IFA检测结果表明所制备的多克隆抗体具有良好的特异性,能够特异性地识别PRRSV感染宿主细胞后病毒自身产生的ns p4;2.nsp4蛋白质组学研究:将nsp4克隆入真核表达载体pEGFP-C1中,构建nsp4真核表达载体,将重组质粒pEGFP-C1-nsp4重组质粒转染293T细胞大量表达,利用G FP-Trap beads进行pulldown实验沉淀出与nsp4相互作用的细胞蛋白。Western blot方法验证pulldown实验操作成功后,将pulldown产物送去质谱分析,获得45个与nsp4相互作用的细胞蛋白;3.nsp4相互作用细胞蛋白的筛选与鉴定:从质谱分析结果当中筛选出与nsp4相互作用可能性高的三种细胞蛋白MYH10,SRCAP、TRIM28。Wester n blot方法结果表明Pulldown产物中确实存在MYH10、TRIM28;分别用MYH10,S RCAP、TRIM28抗体做免疫共沉淀结果表明CO-IP产物中都存在GFP-nsp4融合蛋白;激光共聚焦表明MYH10,SRCAP、TRIM28与nsp4均有不同程度的共定位现象,MYH10,SRCAP、TRIM28与HP-PRRSV也存在明显的共定位。综上所述得出结论:PRRSV nsp4与MYH10,SRCAP、TRIM28三种细胞蛋白相互作用。