立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）是一个主要以菌核形态习居于土壤中的植物病原真菌,其寄主范围广泛,能引起水稻、玉米、小麦等主要农作物发病,危害十分严重。由立枯丝核菌引起的水稻纹枯病（Rice sheath blight）如今已成为世界性水稻的三大病害之一,在世界范围内,几乎没有稻田不会被纹枯病所侵害,而且其发病趋势越来越重。立枯丝核菌无性态Rhizoctonia solani为半知菌亚门真菌,有性态Thanatephorus cucumeris称瓜亡革菌。由于该病菌难以产生担孢子、不产生无性孢子、以及存在多核现象,目前缺乏高效的遗传转化系统等因素导致水稻纹枯病菌的分子生物学特性研究相对滞后,甚至难以开展。导致目前对水稻纹枯病菌的致病机理不够了解,同时在水稻育种方面也缺乏对此病免疫或者高抗的水稻品种也是导致该病暴发的一个重要因素。传统的分子生物学的方法是以单个基因为研究基础,这样的研究非常的费时费力,效率也比较低。另外,蛋白质在生物细胞中往往不是单个起作用,而是与其他细胞相互作用而形成的一个作用网络,每个蛋白只是复杂网络中的很小一部分。因此需要一种比试验技术更高效全面的方法来使我们从全局上了解水稻纹枯病菌。本研究基于这样的想法,利用生物信息学的方法构建了水稻纹枯病菌的蛋白质互作（protein-protein interaction, PPI）网络,并通过计算模型和酵母双杂交实验验证了所做网络的可信度。另外根据生物信息学的方法预测的重要致病基因,我们用反向遗传学的方法对丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase, MAPK）信号转导途径的STE12基因进行敲除,鉴定和功能研究。主要结论如下：1.利用两种最为普遍的蛋白质互作网络预测的方法,即同源映射法和结构域相互作用的方法预测水稻纹枯病菌的蛋白质互作网络图。我们运用果蝇、线虫、人类、酵母和稻瘟病菌的蛋白互作网络,通过同源映射的方法得到在纹枯病菌中包含1991个基因的8312对互作。另外,我们利用DOMINE数据库中的Pfam部分数据,通过结构域相互作用的方法得到在纹枯病菌中包含4780个蛋白对1336786对互作。最后我们通过整合同源映射和结构域相互作用这两种预测方法的重叠数据和在同源映射中Inparanoid算法的可信度分值大于0.5的蛋白组成的互作一起构建成一个高可信度的包含1773个蛋白的6705对互作的纹枯病菌蛋白互网络,其中有3166（47.12%）的互作数据与蛋白质结构域之间互作预测的方法重合。大约有三分之二的蛋白质互作数据来源于稻瘟病,而只有极其少的部分来自于人类,这估计与它们之间的进化亲缘关系相关。2.通过使用GO注释的方法和基因共表达的方法对我们所构建的水稻纹枯病菌蛋白质互作网络进行可信度评估。由于相互作用的蛋白质之间具有相似或者相关的功能,他们之间或多或少的会共享一些GO注释条目,所以我们比较预测网络中蛋白质共享GO注释条目的数目与相同大小的随机网络的蛋白质共享GO注释条目的数目,结果发现预测网络明显比随机网络中的相互作用共享更多的GO注释,说明预测网络中的蛋白更倾向于有功能相关性。其次,由于相互作用的蛋白倾向于拥有相似或者互补的基因表达谱,即具有较高的（Pearson correlation coefficients, PCCs）值,通过分析水稻纹枯病菌AG1 IA在侵染时期的转录组分析,得到了10103个基因的表达谱。通过对比预测网络和相同大小随机网络中拥有相同PCC值的蛋白质互作对数,结果显示在拥有相同PCC值的情况下,预测网络中的蛋白互作对数明显高于随机网络,说明预测网络中的基因更倾向于与具有共表达谱的基因发生相互作用。3.为了更进一步在实验室验证所预测的纹枯病菌蛋白质互作网络,我们使用酵母双杂交的方法验证网络中随机选择的一个节点AGlIA₀5961所编码的蛋白和与之互作的蛋白作用组验证。结果显示在选择的11对蛋白互作组中,有两个蛋白能单独激活酵母报告基因而被放弃使用酵母双杂交的方法检测（AG1IA₀3263和AG1IA₀6033）,而在剩下的蛋白质互作组中,使用严格的筛选条件显示有四对蛋白质显示出强烈的互作,能激活酵母报告基因,而自身不显示具有自激活活性（AGlIA₀5961和AG1IA₀0962、AG1IA₀5961和AG1IA₀0847、AG1IA₀5961和AG1IA₀0059、AG1IA₀5961和AG1IA₀5186）。由于严格的筛选条件必然会让我们失去一些较弱的互作,所谓我们再将筛选条件稍微降低,又发现了三组蛋白具有较弱的相互作用（AG1IA₀5961和AG1IA₀4857、AG1IA₀5961和AG1IA₀1360、 AG1IA₀5961和AG1IA₀2195）,这些结果为我们后续的分析和实验提供了更好的指导。4.为了更深入仔细研究预测的纹枯病菌蛋白网络中的各个亚单位,我们构建了由致病基因和分泌蛋白所组成的子网络,使我们对该病原菌的致病机理有了更加深入的了解。特别是对分泌蛋白的了解,使我们能更好的知道纹枯病菌与水稻之间的互作,对水稻的防卫机制和纹枯病菌的侵染机制了解的更清楚。我们还挑选了重要的一些蛋白进行具体分析,结果显示,如果中心蛋白与致病相关,那么与之发生互作的蛋白则极有可能也与致病相关,这对我们定义一些以前没有发现的并不知道功能的蛋白提供了很好的依据。5.为了更为精确的鉴定与致病相关的基因,我们进一步对所构建的致病网络和分泌网络进行转录组分析。通过整合转录组数据和致病相关的网络,得到了在侵染过程中由表达量变化的基因组成的相关致病网络,同时对网络中一些重要基因的详细分析也发现,如果中心蛋白与致病相关而且表达量发生变化,则与之互作的蛋白也基本上会表达量变化,而且在其它物种中这些基因都和致病相关。对分泌蛋白网络中与核糖体相关蛋白的研究发现,与核糖体蛋白互作的很多蛋白也是与核糖体蛋白。6.我们还对水稻纹枯病菌和稻瘟病菌的促分裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase, MAPK）相关基因构成的网络进行比较研究。其中包括水稻纹枯病菌相关的20个基因构建了158个互作蛋白对和稻瘟病菌种的40个基因的437个互作蛋白对,结果显示在稻瘟病菌和纹枯菌的MAPK蛋白网络中存在很多相同的组分,如Fks1、Rho1和Pbs2。但是这两种病原菌也存在很多不同的地方,如Gpe1、Ste4、Stel8和Ssk2只在纹枯菌中发现,而Cdc42、Bck1、Slt2和Hog1只在稻瘟病菌种发现。另外,我们对MAPK信号传导途径中的细胞壁完整性途径（CWI）的核心蛋白和与发生相互作用的蛋白作用组进行详细分析,也得出了同样的结论,在细胞壁完整性途径中,这两种水稻病原真菌有两个相同或者相似的蛋白Rho1和Pkc1,与这两个蛋白互作的蛋白在这两种水稻病原菌中有两个相同或者相似的功能,但是在这两个病原菌中也存在各自特有的蛋白,这些结果说明MAPK途径在各个不同的病原菌中虽然具有保守性,但是也有其特异性,这些不同估计是由于两种病原菌的生活方式和侵染过程等不同造成的。7.为了进一步我们生物信息学预测的致病基因的功能,我们选择水稻纹枯病菌MAPK级联途径Fus3/Kss1通路下游的一个基因STE12进行分析,以明确STE12基因在水稻纹枯病菌Fus3/Kss1-homolog途径在生长发育及致病过程中的调控作用。分析显示该基因ORF区为3218bp,含有5个内含子,CDS为2643bp,含有880个氨基酸,分子量为96.0494KDa,理论等电点pI为6.37。进一步分析得知该蛋白存在两个C端C2H2锌指双结构域,一个Ste结构域和一个新型结构域,与其他很多病原真菌具有相似的结构域。8.为了明确该基因在水稻纹枯病中的功能,我们采用反向遗传学的方法对STE12基因进行基因敲除以验证其在水稻纹枯病菌中的作用。通过构建了同源重组载体,通过PEG-CaCl2介导的遗传转化方法,获得了STE12同源重组转化子的突变体△STE12。使用半定量和定量PCR分析的方法,进一步说明该基因在敲除突变体中的表达量明显低于野生菌株。为了进一步了解我们所构架的载体在野生型纹枯病菌基因组DNA上的整合情况,我们采用Southern杂交的方法,结果显示STE12基因在水稻纹枯病菌基因组中以单拷贝的形式存在。而突变株ΔSTE12的生长速度比野生型菌株稍慢,菌丝老化的时间变长,产生的菌核较少,而且还与野生型菌株表现出体细胞不融合。9.通过对突变株ΔSTE12的进行水稻叶片的离体接种测试其致病力,结果表明△STE12突变体对水稻叶片的致病力大大下降甚至丧失。可以推测该基因在水稻纹枯病菌中参与调控与致病相关基因的表达,因为STE12是MAPK途径中靠下游的转录因子,而且参与了致病基因的调控,结合其他植物病原菌在MAPK信号传导途径中的相关分析,我们预测可能在STE12下游存在多个其他的基因才参与营养生长等功能的调控。