草莓镶脉病毒(Strawberryveinbandingvirus,SVBV)是一种严重危害草莓的潜隐性病毒,在全世界范围内广泛分布,目前,SVBV在我国河南、河北、吉林等省都有报道,给我国草莓生产造成严重损失。SVBV属于花椰菜花叶病毒科花椰菜花叶病毒属,基因组为双链环状DNA,大小约为7.8kb,含有7个ORFs。为了深入研究SVBV在寄主体内的复制、移动以及病毒致病因子与寄主因子的相互关系,本研究构建了SVBV的侵染性克隆。另外,SVBV的致病性强弱与其ORFVI基因编码的P6蛋白密切相关,本研究克隆了SVBV的ORFVI基因并进行原核表达,制备出特异性抗血清,可为深入研究P6蛋白的具体功能奠定基础,对阐明病毒在寄主体内的致病机制具有重要意义。　　1.SVBV侵染性克隆的构建　　SVBV基因组全长7.8kb,pSVBV-E3为SVBV全基因组克隆,SVBV含有EcoRI和BamHI两个单酶切位点,首先利用EcoRI和BamHI双酶切pSVBV-E3,获得约4kb的0.5拷贝SVBV(0.5SVBV),将0.5SVBV插入到同样酶切的双元表达载体pBinPLUS,获得重组载体pBin-0.5SVBV。然后EcoRI单酶切pSVBV-E3,获得1拷贝的SVBV全长序列,将其正向插入到EcoRI酶切的pBin-0.5SVBV中,获得重组载体pBin-1.5SVBV。　　2.SVBV侵染性克隆的转化、接种和检测　　将重组质粒pBin-1.5SVBV电击转化农杆菌GV3101,筛选阳性克隆。农杆菌浸润法接种本氏烟(Nicotianabenthamiana)、三生烟(N.tabacumvar.SamsunNN)、心叶烟(N.glutinosa)和森林草莓(Fragariavesca);另外,利用基因枪法将重组质粒pBin-1.5SVBV转入森林草莓和本氏烟。浸润接种及基因枪轰击20天后观察,4种植物均没有表现出任何特异性症状。提取各植物新长出的系统叶片基因组DNA,PCR检测SVBV基因特异性片段,发现能够在本氏烟、三生烟和心叶烟上系统叶中检测出SVBV,而利用基因枪轰击的草莓和本氏烟新生长的系统叶中检测不到SVBV。　　3.SVBVORFVI基因编码P6蛋白的表达和纯化及抗血清制备　　PCR扩增SVBVORFVI基因,插入原核表达载体pET-SUMO获得重组质粒pET-SUMO-ORFVI。转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导与Ni2+-NTA亲和柱纯化,获得分子质量约为90kD的重组蛋白。以纯化的重组蛋白为抗原免疫家兔制备抗血清,间接ELISA测定抗血清效价达1256000∶。Western-blot分析表明,该抗血清能够检测到稀释64000倍的重组蛋白。进一步的间接ELISA试验表明,制备的抗血清在较高的稀释度下(1512000∶),可以检测到SVBV中国分离物及美国分离物ORFVI基因在本氏烟中的瞬时表达。