绿僵菌和白僵菌防蝗菌株的分子鉴定及室内致病力测定

来源 :安徽农业大学 | 被引量 : 4次 | 上传用户:ajie830510
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绿僵菌和白僵菌已广泛运用于害虫生物防治中,且被开发成不同剂型的高效真菌杀虫剂。目前防治蝗虫的杀虫剂较多,但是真正有效的杀蝗真菌杀虫剂仍然寥寥无几。因此筛选高毒杀蝗的昆虫病原真菌菌株,可为蝗虫的生物防治奠定坚实的基础。本论文首先采用DGGE方法筛出不同基因型菌株,再进行EF序列的扩增和测序,通过比对和构建系统发育树,将各菌株准确鉴定。然后在菌株室内致病力的测定研究中主要采用浸虫法和饵剂喂食法来确定致病力较强的菌株。最后通过对高致病力菌株部分生物学特性测定,为筛选出生产性状良好的菌株提供必要数据。现将主要结果陈述如下:1、菌株的分子鉴定。(1)球孢白僵菌菌株DGGE初筛。通过DGGE图谱分析,结果显示:检测的27株球孢白僵菌共有6个基因型,分别为基因型A: Bb854,基因型B:Bb1028、Bb6、Bb860、Bb125,基因型C:Bb292、Bb654、Bb1179、Bb2270、Bb321、Bb322、Bb458、Bb859、Bb1372、Bb1843、Bb2153、Bb2157、Bb2248、Bb2250、Bb2251,基因型D:Bb1519、Bb2253、Bb1906、Bb1975,基因型E:Bb1062、Bb2268,基因型F:Bb324。(2)菌株EF序列测定、比对及分子鉴定。从6个基因型中各选择1株球孢白僵菌,结合初步形态学鉴定为其他种的4株菌株Vl325、Ic449、Bbr91、Ma63共10株,分别提取基因组DNA,以983F、2218R为引物进行PCR扩增,测序。在GenBank上进行Blast比对,同源性比对结果表明:6个基因型的菌株之间的序列均有一定差异,差异在99%以内,但都和球孢白僵菌的模式菌株近似,序列差异在99-100%之间。通过序列比对和系统发育树分析,结果表明:通过DGGE研究的6个基因型共27株菌株均可鉴定为球孢白僵菌Beauveria bassiana。其他4株非球孢白僵菌的虫生真菌菌株Vl325、Ic449、Bbr91和Ma63分别鉴定为刀孢蜡蚧菌Lecanicillium psalliotae、环链棒束孢Isaria cateniannulata,布氏白僵菌Beauveria brongniartii、蝗绿僵菌Metarhizium acridum。将这些已明确分类地位的菌株,再结合它们的产孢特点,最终确定以下菌株进行室内生测试验:Bb6、Bb860、Bb292、Bb654、Bb1179、Bb2270、Bb1519、Bb1906、Bb2253、Bbr91、Ma63。2、室内致病力测定。(1)蝗虫室内饲养。蝗卵在30℃,相对湿度50~75%,光照12h的孵化天数为6~12d,结果表明:蝗卵孵化率在59.0~71.2%之间,其平均孵化率达到了65.0%。蝗蝻在25~30℃,湿度30~50%,光照12~16h,结果表明:蜕皮天数为7~8d。从蝗卵孵化到我们所需要的3龄蝗蝻,共需27-36天。(2)室内致病力测定。在室内用浸虫方法测定了11株菌株对东亚飞蝗3龄蝗蝻的致病力,初步筛选出死亡率较高的4株球孢白僵菌和1株金龟子绿僵菌,结果显示:校正死亡率较高分别为100%、93.3%、90%、86.7%、83.3%,致病力顺序为Bb860>Ma63>Bb1906>Bb2270>Bb1519,它们LT50分别为3.04d、4.17d、4.37d、4.50d、5.76d。然后采取浸虫和喂食饵剂的方法,对初步筛选出的5株菌株进行进一步研究。结果表明:喂食饵剂的情况下,Ma63、Bb860、Bb2270、Bb1906对3龄蝗蝻的死亡率最高,LT50最短分别为4.81d、4.37d、5.00d、5.94d。采用浸虫方法的情况下,菌株致死中浓度LC50的顺序依次为Bb860<Ma63<Bb1906<Bb2270<Bb1519,LC50分别为2.274×105孢子·ml-1、5.904×105孢子·ml-1、7.332×105孢子·ml-1、7.378×105孢子·ml-1、8.954×105孢子·ml-1。不同温度条件试验中,20℃下菌株Bb860、Bb1906、Bb2270、Ma63、Bb1519的校正死亡率依次为75.9%、72.4%、69%、69%、55.2%,致死中时依次为6.77d、7.32d、7.45d、7.75d、9.44d。25℃下菌株Bb860、Ma63、Bb1906、Bb2270、Bb1519的校正死亡率依次为100%、100%、89.7%、89.7%、82.8%,致死中时依次为3.13d、4.10d、4.53d、4.39d、5.87d。3、高致病力菌株的生物学特性通过对Ma63、Bb860、Bb1906、Bb2270四株菌株的菌落形态、分生孢子形态、产孢量、萌发率及生长速度几方面的研究,进一步了解菌株的生物学特性。研究结果表明:Bb860、Bb1906和Bb2270均菌落表面疏松、绒毛状,孢子近球形,单细胞,大小在1.5~2.8×1.5~2.4μm范围,Bb2270呈淡黄色,且背面黄棕色,而Bb860、Bb1906菌落白色,背面均为淡黄色。菌株Ma63为紧密、绒毛状,孢子圆柱形,两端顿圆,单细胞,3.8~5.3×2.4~3.3μm,正面黄绿色,背面橄榄色。菌株产孢量测定结果显示:Bb860>Bb2270>Ma63>Bb1906,依次为2.8×107个/cm2、2.3×107个/cm2、2.0×107个/cm2、1.3×107个/cm2;其中孢子萌发率分别为98.0%、96.7%、93.7%、96.0%;Bb860、Ma63、 Bb1906、Bb2270菌落在25℃SDAY培养基上平均每天生长量分别为18.36mm、14.94mm、14.66mm、14.89mm。
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