论文部分内容阅读
目的本研究分析了类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA)患者和正常人群TNF-α、TNFR1、TNFR2、BAFF、BAFF-R、HLA等基因单核苷酸多态性,并寻找基因多态性与RA的相关临床指标和评分,如:RF、CRP、ESR、PLT、抗CCP抗体、HAQ、DAS28、VAS评分等的相关性;同时探讨TNF-α在RA患者血清中的表达水平及其参与RA发病的具体机制。方法2014年7月-2017年3月从安徽医科大学第一附属医院在知情同意的情况下,募集汉族初诊RA患者140例,同期在该院体检中心募集汉族健康体检者149例。从RA患者及健康体检者外周血中提取DNA,采用PCR-连接酶检测反应(ligase detection reaction,LDR)法检测TNF-α、TNFR1、TNFR2、BAFF、BAFF-R和HLA基因的7个SNP位点基因型,并应用SHEsis在线软件进行分析。同时收集患者RF、CRP、ESR、PLT、抗CCP抗体、HAQ、DAS28、VAS评分等实验室和临床指标,分析SNPs与它们的相关性。采集40例RA患者和40例健康对照外周血,分离血清,用ELISA法检测TNF-α的含量。分离PBMCs后用流式细胞术直接检测RA患者和正常人群CD19+B细胞、CD19+CD27+B细胞、CD19+CD20+CD27+B细胞的百分比;进一步将洗涤后PBMCs加入TNFR2单克隆抗体、FITC标记的山羊抗小鼠二抗、抗人CD19-APC抗体进行标记染色测定CD19+TNFR2+B细胞百分比;体外TNF-α刺激PBMCs实验中,用终浓度为100ng/ml的TNF-α刺激正常人PBMCs培养48小时,流式细胞仪检测TNF-α刺激前后PBMCs的B细胞亚群百分比。免疫磁珠分选获得B细胞,运用Western blot检测RA患者和正常人群的MKK3-P38MAPK/NF-κB信号通路相关蛋白MKK3、Phospho-p38MAPK和Phospho-NF-κB p65的表达水平;同时检测经TNF-α刺激前后正常人B细胞MKK3、Phospho-p38MAPK和Phospho-NF-κB p65的表达水平。所有数据采用SPSS13.0软件进行数据录入和统计学分析。实验结果用均数±标准差(mean±SD)表示,组间差异采用单因素方差分析或非参数检验方法(Mann-Whitney U法);SNP基因型应用SHEsis在线软件(http://analysis.bio-x.cn/my Analysis.php)进行分析,对照人群需符合Hardy-Weinberg平衡定律,P<0.05表示差异有统计学意义。部分数据分组比较运用Bonferroni检验校正检验水准。结果(1)RA患者和正常人群TNF-α、TNFR1、TNFR2、BAFF、BAFF-R和HLA基因单核苷酸多态性的差异:本研究显示:TNFR2基因rs1061622位点的G等位基因频率在正常人群和RA患者间有显著性差异(22.8%vs15.7%,P=0.031,OR=0.631,95%CI:0.414~0.960),其它基因SNP位点基因频率在正常人群与RA患者之间无显著性差异。进一步对TNFR2基因rs1061622位点的基因型模式分析显示,TNFR2基因rs1061622位点GG基因型在正常人群中的频率高于RA患者,TT基因型在RA患者中的频率高于正常人群,提示TNFR2基因rs1061622与RA发病相关。而HLA基因在正常对照的频率分布与理论评估值有显著差别(P<0.05),不符合HWE,予以剔除。(2)RA患者TNF-α、TNFR1、TNFR2、BAFF基因单核苷酸多态性与RF、CRP、ESR、PLT、抗CCP抗体、HAQ、DAS28、VAS评分等实验室和临床指标相关性分析:TNFR2基因rs1061622位点最小等位基因频率主要分布于DAS28评分中等值组和高值组(分别为16.7%和18.5%),而在DAS28低值组明显减少(4.2%),差异具有显著统计学差异(P=0.012,Bonferroni检验)。其它实验室和临床指标与上述各基因单核苷酸多态性均无明显相关。(3)流式细胞术检测RA与正常对照组B细胞分化的比较:结果显示:RA患者B细胞(CD19+)、活化B细胞(CD19+CD27+)、记忆性B细胞(CD19+CD20+CD27+)的比例均高于健康人群,而且RA患者外周血中表达TNFR2的B细胞所占百分比也显著高于健康人群;健康人外周血B细胞经TNF-α刺激后发现B细胞(CD19+)、活化B细胞(CD19+CD27+)、记忆性B细胞(CD19+CD20+CD27+)的比例显著升高。ELISA法检测RA患者血清中TNF-α平均水平显著高于健康人群(P<0.01)。(4)Western blot检测显示:RA患者B细胞中MKK3、Phospho-p38MAPK和Phospho-NF-κB p65的表达水平明显高于健康人群;正常人B细胞经TNF-α刺激后,MKK3、Phospho-p38MAPK和Phospho-NF-κB p65的表达水平也显著上调。结论(1)TNFR2基因rs1061622位点的G等位基因频率在汉族RA患者和正常人群有显著性差异,TNFR2基因rs1061622位点单核苷酸多态性与RA发病相关;TNFR2基因rs1061622位点最小等位基因频率与DAS28评分具有明显的相关性,与RA的活动性相关;(2)RA患者外周血中TNF-α水平和B细胞活化程度高于正常人群,TNF-α可能通过与B细胞TNFR2结合激活MKK3-P38MAPK/NF-κB信号通路,促进了B细胞的增殖和分化,从而参与RA的发病。