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背景:
妊娠期高血压疾病(HDCP)是导致孕产妇及围生儿死亡的主要疾病,其病因和确切的发病机理目前仍不清楚。目前大多数学者认为子痫前期的发病与妊娠期间母体对于来自父系抗原的免疫适应不良引起胎盘缺氧,胎盘细胞滋养细胞浸润能力异常,螺旋动脉重塑障碍、胎盘组织合成和释放大量细胞因子进入母体循环引起一氧化氮(nitricoxide,NO)活性下降,活性氧簇(reactiveoxygenspecies,ROS)增加、进而导致肾脏功能受损,外周阻力增加而引起高血压。间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)因具有免疫调节作用而起到维持免疫耐受的作用。异基因的胎儿被认为是异基因的移植物,维持妊娠的相关耐受机制与移植耐受机制相似。
目的:
研究脐带来源的间充质干细胞(HU-MSCs)对血管紧张素受体自身抗体诱导的妊娠期高血压疾病模型大鼠的治疗作用及机制,为HU-MSCs对妊娠期高血压疾病的临床治疗提供理论依据和实验基础。
方法:
1、建立酶消化法和组织块培养法分离培养HU-MSCs,对细胞的一般形态、免疫表型进行鉴定,应用含绿色荧光蛋白的慢病毒(LV-GFP)转染HU-MSCs,免疫组化方法检测血红素氧化酶1(hemeoxygenase1,HO-1)在HU-MSCs中的表达情况。
2、大鼠源性的血管紧张素Ⅱ1型受体(AngiotensinⅡtype1Receptor,AT1R)第二胞外环的多肽片段偶联血蓝蛋白(KLH)制备免疫原对大鼠进行免疫16w,使用溴化氰活化琼脂糖凝胶4B(Sepharose4BCNBr)亲和纯化血管紧张素受体自身抗体(AT1-AA),采用心肌跳动频率的变化鉴定所得的抗体,HE染色和PAS染色观察肾脏的病理改变。
3、大鼠妊娠12d和14d尾静脉注射AT1-AA造成妊娠期高血压疾病大鼠模型。AT1-AA注射半天后,将注射AT1-AA的妊娠大鼠随机分成两组:接受HU-MSCs的治疗组(AT1-AA+MSCs组,n=7)和未治疗组(AT1-AA组,n=7)。对照组为在相应妊娠天数注射0.9%生理盐水的正常妊娠大鼠(NP组,n=6)。应用免疫荧光切片技术检测注射后的LV-GFP标记的HU-MSCs在大鼠肾脏、胎盘和三角区以及胎鼠心脏、肺脏、肾脏和肝脏中的分布。妊娠第11、15和19d采用无创尾静脉大鼠血压仪检测大鼠血压。妊娠第20d处死大鼠,检测HU-MSCs对胎鼠体重,胎鼠肾脏和肝脏发育情况,大鼠肾脏病理,螺旋动脉重塑的影响,并且检测肿瘤坏死因子α(tumornecrosisα,TNF-α)、白介素10(intedeukin1O,IL-10)和HO-1因子的变化。
结果:
1、HU-MSCs呈现出成纤维样的形态。应用LV-GFP转染HU-MSCs72h后转染率达80%以上。流式细胞仪检测HU-MSCs免疫表型,结果显示各代细胞均表达CD73、CD90和CD105不表达表面标记CD34、CD45、CD19,CD11和HLA-DR。HU-MSCs的细胞质内存在HO-1的强烈表达。
2、应用心肌细胞跳动频率检测AT1-AA的活性表明,AT1-AA(1:50)能够引起心肌跳动频率显著增加(11.36±2.49bpm),氯沙坦(1.0～μmol/L)能够阻断AT1-AA引起的心肌跳动频率增加(1.29±1.77bpm＞,这说明提取的AT1-AA具有活性。
3、通过给予健康SD大鼠尾静脉注射AT1-AA造模后,在妊娠第19d,AT1-AA组大鼠血压较NP组显著升高,经统计分析P＜0.05,有统计学意义;AT1-AA组大鼠肾脏出现损伤、螺旋动脉重塑障碍;.AT1-AA组胎鼠体重较NP组显著下降,经统计分析P＜0.05,有统计学意义:AT1-AA组与NP组相比胎鼠肾脏、肝脏发育不良。
4、通过HU-MSCs注射治疗妊娠期高血压疾病模型大鼠后,AT1-AA+MSCs组大鼠血压较AT1-AA组显著下降,经统计分析P＜0.05,有统计学意义;AT1-AA+MSCs组大鼠肾脏损伤较AT1-AA组减轻,螺旋动脉重塑障碍情况较AT1-AA组减轻;AT1-AA+MSCs组胎鼠体重较AT1-AA组显著升高,经统计分析P＜0.05,有统计学意义;AT1-AA+MSCs组胎鼠肾脏、肝脏发育情况较AT1-AA组好转,经统计分析P＜0.05,均具有统计学意义。
5、通过对各组大鼠血清免疫因子TNF-α和IL-10的检测,发现大鼠给予AT1-AA组促炎症因子TNF-α较NP组比较有所升高,经统计分析P＜0.05,具有统计学意义,而抗炎症因子IL-10却下调了,与NP组比较其同样具有统计意义。给予HU-MSCs注射的AT1-AA+MSCs组较AT1-AA组促炎症因TNF-α的表达下调,而抗炎细胞因子IL-10的表达上调,经统计分析P＜0.05,具有统计学意义。
6、通过Realtime-PCR对各组大鼠胎盘和三角区组织中的因子TNF-α,IL-10和具有细胞保护作用的因子HO-1的检测,发现大鼠给予AT1-AA注射后TNF-α被上调,HO-1被下调,AT1-AA组与NP组比较,经统计分析P＜0.05,具有统计学意义。给予HU-MSCs治疗后,TNF-α被下调,HO-1被上调,AT1-AA+MSCs组与AT1-AA组比较,经统计分析P＜0.05,具有统计学意义。胎盘和三角区中IL-10mRNA在各组之间未见显著性差异。
7、LV-GFP标记后HU-MSCs注射到AT1-AA+MSCs组大鼠体内后,在荧光显微镜下直接寻找GFP的绿色荧光结果表明,在大鼠的胎盘和三角区及肾脏组织中仅能找到少许HU-MSCs,在胎鼠的心脏、肾脏、肝脏和肺脏中均未见HU-MSCs。
结论:
1、人类脐带组织可以分离出HU-MSCs,LV-GFP体外标记细胞效率高,可以作为良好的细胞移植的细胞示踪材料。HU-MSCs的细胞浆中存在较强的HO-1表达。
2、大鼠源性AT1R多肽能够诱导大鼠产生AT1-AA,本实验证实了大鼠源性AT1-AA的存在,并成功的对抗体进行分离、纯化,证实了AT1-AA能够引起免疫大鼠肾脏损伤。
3、静脉注射HU-MSCs能够降低AT1-AA诱导的妊娠高血压大鼠疾病的血压,改善胎鼠体重及胎鼠肾脏和肝脏发育,减轻肾脏损伤,改善螺旋动脉重塑。HU-MSCs可能是通过调节免疫失衡及通过旁分泌机制促进细胞保护性因子HO-1的释放来实现对妊娠期高血压疾病的治疗。