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研究背景 新生儿缺氧缺血性脑病(Hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE)系围生期窒息，缺氧所致的严重并发症，是引起智力落后和脑性瘫痪的主要原因之一。因此对于HIE发病机制及治疗研究至关重要。目前对其发病机制的分子生物学研究表明，缺氧缺血性脑损伤是多种因素介导和参与的分子病理过程，诸多因素在病变发生和发展中起不同作用。近年对血红素氧化酶及其催化血红素产生的内源性一氧化碳在HIE发病机制中的作用研究日益受到重视。最近研究表明，血红素氧化酶-1(Heme oxygenase-1，HO-1)是血红素降解的起始酶和限速酶，催化分解血红素产生胆绿素、铁离子和一氧化碳(CO)，是缺氧缺血过程中变化敏感指标；细胞凋亡是缺氧缺血性脑损伤(Hypoxicischemic brain damage，HIBD)后细胞死亡的主要形式，在轻度缺氧缺血性脑损伤后神经元丢失起主要作用，但HO-1在HIBD中的作用及HO-1与脑细胞凋亡的关系尚不明确。本研究采用原位杂交，免疫组化及原位切口末端标记的方法来研究HO-1在HIBD后不同时间点海马区的表达变化规律，检测细胞凋亡，从而探讨HO-1在缺氧缺血性脑损伤中的作用和脑细胞凋亡可能的机制，为研究HIE发病机制及临床治疗提供理论依据。第四军医人学硕卜学位论文 日的研究新生大鼠缺氧缺血性脑损伤后海马区血红索氧化酶一1的表达变化;检测海马神经细胞凋亡的情况。从而探讨血红素氧化酶一1与新/l泣儿缺氧缺血性脑病发病的关系:一孚求临床治疗Il]E新途径。 方法(l)动物模型的制备:七日龄SD仔鼠72只，随机分为日IBD组和假手术对照组，!一川犯组分别结扎右侧预总动脉，以1一2升/分的速度输入含8%氧气和92%氮气的混合气体，持续2小时，建立HIBO的动物模型;假手术对照组仅游离而不结扎动脉，不进行缺氧处理。(2)实验标木制备:两组动物分别在不同的时间点取脑组织标本制作石蜡切片。(3)应用苏木索一伊红染色观察海马区脑组织病理形态损伤;分别采用原位杂交、SABC免疫组化染色研究HO一lmRNA和蛋白表达;原位切口木端标记的方法检测海马区凋一亡细胞。(4)于400倍光镜下计数5个视野平均阳性细胞数，数据以均数士标准差(万士s)表示，统一计处尸U采川51〕55 10.0软件进行t检验。 结果 1.光镜下脑组织海马区的病理改变:(1)假手术对!狱组在各个时间点脑组织切片染色未见明显缺氧缺血表现。(2)l IIBI)组右侧海马在缺氧缺血后即刻无明显损伤性改变;12小时可见少量神经细胞肿胀，细胞淡染，神经细胞的数量略有减少;铭小时除可见上述变化外，还可见部分坏死细胞，细胞松散间隙J)、‘大，细胞核浓缩，碎裂结构消失，锥体细胞嗜伊红染色;72小时__L述现象进一步加剧，海马CAI区神经元大多数坏死，嗜伊红深染，周边有胶质细胞增生，同时可见少数神经细胞出现核固缩，深染。 2.110--lml褚NA基因转录情况:(l)110一lmRNAI泪性细胞的形态及分布:成熟HO一lmRNA主要分布在细胞浆中，细胞核中亦有少量的”于lmRNA前体。mRNA与地高辛标记的寡核营酸探针结合后，用DAB显色，细胞浆及核膜呈棕黄色。假手术对照组mRNA含第四军医大学硕!:学位论文量低，_且不同的细胞含量有所不同，故原位杂交后显色深浅不一致;HIBD组右侧海马HO一lmRNA转录明显增加，以CAI，CA3的神经元及齿状回的颗粒细胞为主，少量胶质细胞也着色，.且大多数红”胞核着色，分布密集。(2)不同时问点HO一lmRNA检测比较:假手术对照组各时间点HO一lmRNA阳性细胞数无明显差异;HIBD组与假手术对照组在不同的时间点HO一lmRNA转录差异有显著意义，HIBD组右侧海马O小时HO一lmRNA转录与对照组比较无统计学意义(P>0 .05)，4小时表达开始增加(52.8士6.1)(P<0.01)，12小时达高峰(55.7士6.4)(P<0.01)，72小I月‘有所下降(52.3士5.2)(p<0.01)，但仍高于假手术对照组(25.0士5.1)。 3.HO一1蛋白表达情况:HO一1主要分布在核膜和胞浆中，与HO一1多抗结合后，经过DAB染色，使核膜和胞浆呈棕黄色。假手术对照组阳性细胞少，染色较浅;HIBD组右侧海马阳性细胞明显增多，染色较深，_目‘不同的时盯lJ点阳性细胞数与对照红L相比有差异。HIBD组右侧海马4小11寸HO一l表达增)J「I(53.2士5.6) (P<0.()5)，12小时‘达高公帐(10().8士8.7)(P(0.01)，72小l月‘有所下降(74.0士5.1)，但仍高于假手术对照组(32.8士6.7)(p<0.()l)。 4.细)泡凋亡情况:因发生凋亡的细胞内源性核酸内切酶被激活，细胞自身染色质或DNA被切害U，产生与DNA断点数「!相同的3，一经荃末端，与生物素标记的辣根过氧化物酶 (Av记in一HRP)结合后，DAB染色，使细胞核呈棕黄色。假手术对照组阳性细胞极少，HIBD组右侧海马12小时凋亡到11胞数增加(19.67士3.39)(p<0.01)，24小时达高峰(30.17士3.31)(P<0.01)，72小时凋亡细胞减少(14.00士2.83)，但仍高于对照组(9 .17士1.47) (P(0 .05)。 结论 1.正常新生大鼠海马区有少量HO一1mRNA转录，FllBD后 H于lmRNA转录水平明显增高。第四军医人学硕卜学位论文正常新生大鼠海马区有少量110一l蛋白的表达，川BD后110一1蛋