研究背景和目的哺乳类动物海马齿状回是终生具有产生颗粒细胞能力的脑结构。位于齿状回颗粒下区的神经干细胞在受到刺激后分化、发育为成熟颗粒细胞,同时整合至齿状回神经网络。啮齿类动物成年新生颗粒细胞在新生后在经历不同发育阶段后,约需2个月成为与已经存在颗粒细胞在形态、电生理学性质和突触联系相似的成熟颗粒细胞。成年颗粒细胞新生与海马相关的学习、记忆形成以及情绪调节密切相关。许多生理、病理因素可以显著改变成年海马齿状回神经新生。癫痫持续状态后海马齿状回神经新生出现短暂增强。迄今,在癫痫发生中神经新生增强的意义尚存争议。借助于逆转录病毒携带的绿色荧光蛋白(GFP)基因对新生颗粒细胞的标识以及共聚焦成像,本课题研究了匹罗卡品诱导的癫痫持续状态后新生颗粒细胞在发育过程中树突形态、树突棘密度和细胞活性的变化。材料和方法材料：实验动物为雄性SD大鼠(140-170 g,6-7周龄)。方法：1.癫痫持续状态的诱导以及齿状回内注射逆转录病毒载体癫痫持续状态(SE)以腹腔内注射匹罗卡品诱导。选取对Racine氏SE分级Ⅱ级或以上、发作时间长于2小时的大鼠进行后续实验。以腹腔内生理盐水注射的同龄动物作为对照。CAG-GFP逆转录病毒载体在SE诱导第5天以立体定向技术注入海马齿状回。2.灌流和切片制作在CAG-GFP逆转录病毒载体齿状回内注射5天、28天或至少70天后,腹腔内注射戊巴比妥钠麻醉动物后,用4%多聚甲醛经心脏对脑进行灌流固定。取脑后,以4%多聚甲醛对脑进行后固定过夜。在以10%-15%-20%蔗糖磷酸缓冲液对样本进行沉糖处理后,以明胶-白蛋白-戊二醛混合液包埋组织块,经振动切片机制作厚度为100μm或40μm的海马冠状切片。3.免疫荧光染色GFP免疫荧光染色：在普通荧光显微镜下,挑选出含有GFP细胞的100μm厚切片。对脑片进行免疫荧光染色,所用一抗和二抗分别山羊抗GFP以及和Alexa fluor 488结合的驴抗山羊IgG。Arc免疫荧光染色：在普通荧光显微镜下,挑选出含有GFP细胞的40μm厚切片。对脑片进行免疫荧光染色,所用一抗和二抗分别为兔抗Arc以及和Alexa fluor568结合的驴抗兔IgG。NeuN免疫荧光染色：在普通荧光显微镜下,挑选出含有GFP阳性细胞(GFP+)的40μm厚切片。对脑片进行免疫荧光染色,所用一抗和二抗分别为鼠抗NeuN以及和Alexa fluor568结合的驴抗鼠IgG。4.树突复杂性分析对分布于齿状回上支、少与其它细胞重叠、树突分支基本完整的细胞进行z轴连续序列扫描,以此获取神经元胞体以及树突的3D图片。应用ZEN软件对该3D图片进行z轴最大密度投影。在Image J中打开投影后细胞图像,手动描绘出细胞胞体和树突。树突复杂程度以Sholl法进行分析：以神经元胞体中心为圆心,每隔25μm划一同心圆。树突与同心圆交点的数目代表树突复杂性。5.树突棘密度分析对于位于齿状回上支的每一个GFP+颗粒细胞,随机选取中段和末段树突各3段进行高倍镜下的z轴系列扫描,建立各段树突的3D图像,在Image J中对树突棘进行计数。树突棘密度以树突棘数目除以树突长度计算。6.Arc荧光强度分析共聚焦拍摄GFP阳性以及周围GFP阴性细胞(GFP-)Arc荧光图像后,应用Image J软件对GFP阳性颗粒细胞Arc荧光强度进行测定。随机选取同张照片外分子层的10个颗粒细胞,测其Arc荧光强度,计算这些GFP阴性细胞的平均Arc荧光强度。GFP+神经元的活动水平以GFP+神经元的Arc荧光强度值与GFP-细胞Arc荧光强度均值的比值来表示。7.数据统计定量数据用平均值±标准差表示,以Grahpad软件进行统计学检验。P≤0.05,考虑为有统计学差异。结果：1.正常生理条件下和癫痫病理条件下,大鼠海马齿状回均有成年后神经新生现象,应用逆转录病毒介导的GFP标识方法标记的细胞类型有颗粒细胞和胶质细胞。GFP+颗粒细胞分布于颗粒细胞层内1/3,GFP在胞体、轴突、树突均有表达。2. 与对照组同龄颗粒细胞相比,癫痫持续状态后新生颗粒细胞在未成熟阶段(4周龄)树突复杂度更高,而在成熟后(10周龄),树突复杂度没有差异。3. 与对照组同龄颗粒细胞相比,癫痫持续状态后新生颗粒细胞在未成熟阶段(4周龄)位于中分子层的树突棘密度(对照组：1.96±0.05个/μm,n=5；癫痫组：2.23±0.04个/μm,n=4)和蘑菇状树突棘密度(对照组：0.06±0.002个/μm,n=5；癫痫组：0.07±0.002个/μm,n=4)更高。而癫痫持续状态后新生颗粒细胞成熟后(10周龄)与对照组同龄颗粒细胞相比,位于外分子层的蘑菇状树突棘密度(对照组：0.10±0.007个/μm,n=6；癲痫组：0.13±0.01个/gm,n=6)更高。4.对照组和癫痫组未成熟GFP+细胞(4周龄)Arc的荧光强度与周围成熟GFP-颗粒细胞Arc的荧光强度平均值的比值分别为(1.54±0.13,n=3)和(1.45±0.17,n=7),活动水平高于周围成熟颗粒细胞。对照组和癫痫组成熟GFP+细胞(10周龄)Arc的荧光强度与周围已成熟GFP颗粒细胞Arc的荧光强度平均值的比值分别为(1.18±0.10,n=6)和(0.98±0.04,n=6),活动水平与周围成熟颗粒细胞相近。结论：与自然状态下新生的颗粒细胞相比,癫痫持续状态后新生颗粒细胞呈现树突和细胞活动度的发育性改变。癫痫持续状态后4周龄新生颗粒细胞的树突分支较自然状态下新生同龄颗粒细胞复杂,细胞活动度显著高于已存在颗粒细胞,提示细胞的高兴奋性。癫痫持续状态后新生颗粒细胞成熟后的树突复杂度、中段树突棘密度与自然状态下同龄颗粒细胞相似,而细胞活动度低于已存在颗粒细胞。这一结果提示：癫痫持续状态后新生颗粒细胞对齿状回高兴奋性的影响是短暂而非持久的。