莽草酸(Shikimic acid,SA)作为抗禽流感特效药达菲的关键起始原料而备受关注,其衍生物具有抗肿瘤、防止血栓形成等多种功效。白藜芦醇(Resveratrol,Res)及其衍生物具有抗肿瘤、延缓衰老及保护心脑血管等多种功效,在食品和营养补充剂行业应用广泛。目前这两种化合物的生产都主要从植物中提取,对植物资源依赖严重。微生物具有生长代谢快、操作简便等多种优点,越来越多的研究者通过微生物来合成植物来源的重要代谢产物。然而目前的研究大都局限于利用质粒表达载体来强化相关基因,这种方法有其自身缺陷。近年来基因定点整合技术由于其稳定性及良好效果而受到研究者的重视。本研究基于合成生物学原理,首次利用基因定点整合技术改造大肠杆菌BW25113构建SA高产菌株及Res从头合成重组菌株。对于SA生产菌株的构建:(1)敲除下游莽草酸激酶基因aro L和aro K,构建四基因共表达质粒p ETDuet-GBAE,使SA合成的四个关键酶Aro G(3-脱氧-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合成酶)、Aro B(3-脱氢奎尼酸合成酶)、Tkt A(转酮醇酶I)和Aro E(SA脱氢酶)以协同效应的方式促进SA的生产,SA产量达到1.08 g/L;(2)首次尝试通过基因定点整合的方式将上述四个基因定点整合入磷酸烯醇式丙酮酸糖磷酸转移酶系统(PTS)基因pts HIcrr位点,在降低前体磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)消耗的同时促进SA的合成,SA产量提高到2.08 g/L;(3)整合入半乳糖透性酶基因gal P和葡糖激酶基因glk提高葡萄糖转运速率,缩短发酵周期;(4)将PEP合成酶基因pps A整合入代谢调控基因tyr R位点进一步增加PEP的供应,所构建的重组菌株SA5可生产SA 2.83 g/L,是出发菌株BW25113(?aroL/aro K,DE3)的94倍;(5)添加质粒p ETDuet-GBAE再次过表达关键基因,SA产量提高到4.14 g/L,生产率为23.56%;(6)在发酵罐放大培养中,首次尝试使用葡萄糖和甘油混合碳源进行发酵,达到生产速率与持续生产的双赢。最终SA产量可达到27.41 g/L,单位时间产率为0.57g/L·h,是葡萄糖单一碳源的两倍。对于Res生产菌株的构建:(1)将来源于葡萄(Vitis vinifera)的二苯乙烯合酶基因sts定点整合入tyr R基因位点,来源于黏红酵母(Rhodotorula glutinis)的酪氨酸解氨酶基因tal和来源于荷兰芹(Petroselinum crispum)的4-香豆酸Co A连接酶基因4cl定点整合入色氨酸合成相关基因trp ED位点,首次构建真正意义上可利用葡萄糖从头合成Res的重组大肠杆菌Res1,其Res产量达到4.61 mg/L;(2)将来源于三叶草根瘤菌(Rhizobium trifolii)的丙二酰Co A合成基因mat B和丙二酸盐载体蛋白基因mat C定点整合入苯丙氨酸合成相关基因phe LA位点以增加丙二酰Co A的供应,Res产量提高到9.35 mg/L;(3)将SA合成关键基因(aro G、aro B、tkt A、aro E)及葡萄糖转运基因glk和gal P定点整合入pts HIcrr位点以强化上游代谢途径基因,Res产量增加到11.41 mg/L;(4)通过质粒强化Res合成的上述外源基因后Res产量又进一步提高到13.70 mg/L,是菌株Res1的近3倍。(5)在后续研究中尝试添加底物酪氨酸或对香豆酸(p-CA),结果发酵液中出现了两个副产物Res-der1和Res-der2,它们均是p-CA的衍生物。其中Res-der2是p-CA脱羧后的产物4-乙烯基苯酚,其含量随着底物p-CA添加量的增加而增加。据此推测在合成Res的过程中,中间产物p-CA会被脱羧或转化为其它化合物,阻碍4-香豆酰Co A的合成,最终影响Res的进一步生产。总之,本研究利用合成生物学方法,首次通过基因定点整合的方式对相关基因进行过表达,成功构建SA高产菌株及真正意义上从头合成的Res生产菌株,为以后的研究奠定了基础。所构建的重组菌株可组成型表达相关基因,在发酵过程中无需添加诱导剂IPTG及抗生素,具有操作简便、环境友好、适于工业化生产等优点。