第一部分：NEDD4-1、PTEN在垂体瘤中的表达及相关性的研究研究背景垂体腺瘤是临床内分泌科和神经科的常见病,是颅内常见的良性肿瘤,其发病率排在脑胶质瘤和脑膜瘤之后,居颅内肿瘤发病率的第三位。垂体腺瘤在组织学上属于良性肿瘤,但也有一些垂体瘤具有向周围组织浸润性生长的特点,称为侵袭性垂体瘤。侵袭性垂体瘤虽在病理上属于良性肿瘤,但具有向周围正常结构如颅骨、海绵窦、硬脑膜、蝶窦、三脑室、鞍上、鞍旁、斜坡甚至鼻咽腔等位置呈侵袭性生长的特点。目前采取的各种治疗方案均能影响垂体的正常分泌功能,甚至引起低垂体功能,患者长期进行激素替代治疗,痛苦不堪。对垂体瘤的发病机制的研究最近有很大的进展,但确切的机制和机理尚不清楚,因此进一步广泛的研究垂体肿瘤的发生,发展机制将继续成为研究的热点。目前,研究抑癌基因在肿瘤中的变异和表达已成为探索肿瘤病因、发展及预后的一条重要途径,并期望在其中寻找基因治疗的目标基因。发现和阐明相关基因的作用机理,不仅有助于发现能反应肿瘤特异性生物学行为的标志物用于临床诊断和随访研究,更重要的是为制定该类型肿瘤的新型治疗方案提供理论学基础。PTEN(phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome10,第10号染色体同源丢失性磷酸酶-张力蛋白基因)是1997年由三个研究小组(Li& Sun1997,Li etal.1997, Steck et al.1997)同时克隆并命名的一种抑癌基因。PTEN定位于10q23.3,由9个外显子组成,编码由403个氨基酸组成的在细胞质中表现出双重特异性磷酸酶活性的蛋白,PTEN是迄今发现的第一个具有磷酸酶活性的肿瘤抑制基因。国内外大量研究证实,PTEN与脑胶质瘤、子宫内膜癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌的发生、发展有密切关系,而且肿瘤的恶性程度愈高,PTEN表达率愈低,但目前关于垂体瘤中PTEN基因的缺失国内外报道较少。近十余年来,研究已发现PTEN可通过抑制血管生成、阻抑细胞周期、抑制细胞外基质降解、促进细胞分化等作用抑制肿瘤生成。但对肿瘤中PTEN的调控和降解机制的研究较少。NEDD4家族为一类具有E3泛素连接酶活性的蛋白质,NEDD4家族在进化上高度保守,具有一个C2(Ca2+/lipid-binding)结构域,2-4个WW结构域以及1个HECT (homologous to the E6-AP carboxyl terminus)结构域。C2参与膜靶向结合,WW参与蛋白质的相互作用以及底物识别,HECT具有E3的催化活性,负责靶蛋白的泛素化和降解。2007年,Xuejun Jiang实验室鉴定出一种调节PTEN的新成分——NEDD4-1(neural precursor cell expressed developmentally down regulated4-1, NEDD4-1), NEDD4-1在下调肿瘤抑制基因PTEN水平的过程中发挥重要作用,通过向PTEN附加泛素这一分子标志物,促使PTEN在蛋白酶体中降解。然而,在垂体瘤中是否存在NEDD4-1,其表达情况与垂体瘤侵袭性的关系以及和PTEN的相关性,国内尚未见文献报道。目的本实验研究NEDD4-1、PTEN分别在正常垂体组织、非侵袭性及侵袭性垂体瘤中的表达，并对其表达与垂体瘤侵袭性程度的关系进行研究,从而为垂体瘤的早期诊断和治疗提供新的生物学特性的参考指标和理论支持。方法本实验分为正常垂体组织组、非侵袭性垂体瘤组和侵袭性垂体瘤组,正常垂体组织来自术中所取ACTH微腺瘤周围薄层垂体组织。应用RT-PCR法检测40例垂体瘤标本和10例正常垂体组织中的NEDD4-1和PTEN mRNA水平,并进行统计学分析；应用免疫组织化学方法检测10例正常垂体组织标本和50例垂体瘤组织标本中NEDD4-1和PTEN蛋白表达情况,并分析二者之间的相关性。结果1. RT-PCR方法显示NEDD4-1mRNA和PTEN mRNA在垂体瘤和正常垂体组织均有表达,但NEDD4-1mRNA在垂体瘤中表达明显高于正常垂体组织(P<0.05),在侵袭性垂体瘤组中的表达明显高于非侵袭性垂体瘤组(P<0.05)。而PTEN mRNA在垂体瘤中的表达低于正常垂体组织(P<0.05),且在非侵袭性垂体瘤组和侵袭性垂体瘤组中的表达情况与NEDD4-1相反。2.免疫组化结果显示,NEDD4-1蛋白免疫组化阳性表达定位于细胞浆和(或)细胞核,NEDD4-1蛋白在正常对照组和实验组中的阳性表达率分别为10.0%(1/10)和52.0%(26/50),二者相比差异有显著性(P<0.05)。NEDD4-1蛋白表达阳性率在非侵袭性垂体瘤组中为37.5%(9/24),在侵袭性垂体瘤组中为65.3%(17/26). NEDD4-1蛋白表达阳性率随肿瘤侵袭性程度增高有明显增高的趋势,侵袭性分组之间有显著差异(P<0.05)与对照组之间有显著差异(P<0.05)。PTEN阳性表达主要定位于细胞浆,呈棕黄色染色。PTEN蛋白在正常对照组和实验组中的阳性表达率分别为100.0%(10/10)和54.0%(27/50),二者相比差异有显著性(P<0.05)。PTEN蛋白表达阳性率在非侵袭性垂体瘤组中为83.3%(20/24),在侵袭性垂体瘤组中为26.9%(7/26)。PTEN蛋白表达阳性率随肿瘤侵袭性增高呈降低的趋势。侵袭性分组之间有显著差异(P<0.05)与对照组之间有显著差异(P<0.05)。在26例NEDD4-1表达阳性的垂体瘤中PTEN阳性表达有4例,而在PTEN阳性表达的27例中NEDD4-1阴性表达有23例,经统计分析二者表达呈负相关(Υ=-0.806,P<0.05)。结论1.正常垂体组织和侵袭性、非侵袭性垂体瘤中均有NEDD4-1和PTEN表达,并与垂体瘤的侵袭性程度相关。NEDD4-1、PTEN可能与垂体瘤的发生、发展有关。2.垂体瘤中NEDD4-1和PTEN的表达呈负相关。NEDD4-1、PTEN的同时检测可能对判断垂体瘤的生物学特性及预后提供参考。第二部分：NEDD4-1对人垂体瘤细胞中PTEN作用的实验研究目的本实验第一部分研究表明,NEDD4-1与PTEN在垂体瘤的发生、发展过程中可能起着重要的作用,与垂体瘤的侵袭性程度和预后有关,从而为垂体瘤的早期诊断和治疗提供新的生物学特性的参考指标和理论支持。但是NEDD4-1与PTEN在垂体瘤中具体的作用机制还不是很清楚,尚有待进一步的试验研究。本实验第二部分进一步探讨NEDD4-1对GT1.1人垂体瘤细胞中PTEN的作用,为垂体瘤的治疗提供新的途径。方法构建NEDD4-1shRNA表达质粒,酶切、测序鉴定后扩增。然后脂质体2000分别转染pcDNA3.1-NEDD4-1、pGPU6/GFP/Neo-NEDD4-1shRNA及阴性质粒到GT1.1人垂体瘤细胞,经荧光显微镜观察shRNA质粒转染效率确定最佳时间点。分别采用Western Blot、RT-PCR于转染后第48h检测PTEN的蛋白含量及mRNA水平变化。结果1. NEDD4-1shRNA表达质粒的鉴定：将重组NEDD4-1shRNA表达质粒转化感受态细胞DH5a,提取的质粒用BamHⅠ和PstⅠ内切酶分别单酶切,结果显示有2条带,1条为超螺旋的SC构型,1条为质粒的松弛开环的OC构型,可显示重组体不能被PstⅠ所酶切。重组体被BamHⅠ单酶切而线性化,条带大小为5100bp。送目的质粒DNA去上海生工生物技术公司完成测序,T3启动子引物5’-AATTA ACCCTCACTAAAGGG-3,结果显示插入序列完全与设计的shRNA碱基序列完全一致,无突变。2.pcDNA3.1-NEDD4-1真核表达质粒的鉴定：将获赠的pcDNA3.1(+)表达载体转化感受态宿主细胞DH5a,提取的质粒经Hind Ⅲ/EcoRI双酶切,1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定重组子,显示2条DNA片段,一条与pcDNA3.1碱基数相符,约为5.4kb,另一条DNA片段(约5.6Kb)与NEDD4-1碱基数一致,证明获赠质粒为NEDD4-1与pcDNA3.1形成的重组体。3.倒置荧光显微镜下观察转染效率：分别于转染后24h、48h、72h在倒置荧光显微镜下观察转染效率,结果显示：转染组可见绿色荧光,而未转染细胞组未见荧光,提示转染成功。转染后24h,即见到绿色荧光,转染后48h左右表达最强,而72h后绿色荧光减弱、细胞大量死亡。故本实验选择在48h检测PTEN mRNA水平及蛋白表达。4.RT-PCR检测四组细胞PTEN基因表达：RT-PCR产物凝胶电泳结果显示：各组相比条带亮度均无明显变化。利用ImageJ分析软件计算出平均灰度值,将其转化为光密度(OD)后进行定量分析,证明：转染NEDD4-1或NEDD4-1shRNA均不能引起GT1.1人垂体瘤细胞中PTEN基因表达的变化。5. Western Blot检测PTEN蛋白表达：显色后扫描成像显示：与对照组相比,NEDD4-1组条带灰度下降,而NEDD4-1干扰组灰度增加,阴性质粒组条带无明显变化。结果提示：(1)转染NEDD4-1后下调了GT1.1人垂体瘤细胞PTEN蛋白表达。(2)转染NEDD4-1shRNA后上调了GT1.1人垂体瘤细胞PTEN蛋白表达。本实验成功构建NEDD4-1的shRNA表达质粒。经稳定转染后,与空白对照组相比,NEDD4-1组PTEN蛋白含量明显减少(P<0.05),而PTEN mRNA变化不明显(P>0.05),NEDD4-1干扰组PTEN蛋白含量明显增加(P<0.05),而PTENmRNA变化不明显(P>0.05)。结论垂体瘤细胞中NEDD4-1的异常高表达可通过翻译后过程阻抑PTEN表达。