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肝母细胞瘤(Hepatoblastoma,HB)是小儿最常见的肝脏恶性肿瘤,近年来,随着外科技术的进步、化疗方案的改善以及多个儿童肿瘤组织的共同努力,肝母细胞瘤的诊断和治疗取得了显著的进展,但有远处转移或复发病例病死率仍较高。肿瘤复发、转移是HB患儿死亡的首要原因,亦是影响HB患儿长期生存的关键所在。研究发现,上皮细胞粘附分子(epithelial cell adhesion molecule,Ep CAM)在大部分成人上皮来源恶性肿瘤中高表达,其高表达与患者预后相关;有研究发现,Ep CAM在HB肿瘤细胞中也呈高表达,其高表达与HB预后呈负相关,同时,Ep CAM可作为HB的标记物。现在,抗Ep CAM单克隆抗体在多种成人恶性肿瘤已开展临床实验研究,如结、直肠癌,乳腺癌,卵巢癌等,并取得了一定的治疗效果。但到目前为止,Ep CAM与小儿实体肿瘤的关系研究还不多见。本研究拟通过干扰Ep CAM在HB肿瘤细胞中的表达,通过体外和体内实验,探索Ep CAM在HB肿瘤细胞增殖、转移等细胞生物学行为中的作用,以期为抗Ep CAM单克隆抗体在治疗HB的临床应用提供实验基础。目的:通过RNA干扰技术,构建EpCAM基因shRNA慢病毒载体,转染肝母细胞瘤HuH-6细胞,以获得EpCAM基因稳定沉默的HuH-6细胞系,探讨EpCAM对HuH-6细胞增殖、侵袭、迁移、细胞周期、细胞粘附及裸鼠体内成瘤能力等的影响。方法:1.体外培养人肝母细胞瘤HuH-6细胞,设计EpCAM基因的特异性shRNA靶点,构建3条不同的shRNA慢病毒载体并感染HuH-6细胞,采用Real-time PCR方法检测HuH-6细胞中EpCAM的mRNA水平变化,Western Blot方法检测EpCAM蛋白表达水平,鉴定EpCAM基因沉默的效果,选择1条干扰效果最佳的shRNA基因,作为后期研究和病毒包装实验基因,构建基因稳定沉默的细胞系。用不含EpCAM shRNA的质粒慢病毒感染细胞作为阴性对照,未经病毒转染的细胞作为空白对照。2.采用克隆形成实验、MTT试验、细胞划痕实验、细胞迁移实验、流式细胞术及细胞粘附实验等实验方法检测EpCAM基因沉默后HuH-6细胞的增殖、迁移、侵袭和细胞周期、细胞粘附等生物学行为的变化。3.将EpCAM基因沉默后HuH-6肿瘤细胞移植到裸鼠皮下,培养6周后取移植瘤组织,测肿瘤体积及质量,对肿瘤组织行EpCAM、E-cadherin免疫组化染色,免疫荧光检测肿瘤组织细胞凋亡率。结果:1.成功构建3条shRNA-EpCAM慢病毒载体,选择1条干扰效果最佳的shRNA,感染HuH-6细胞,建立EpCAM稳定低表达的细胞系。2.克隆形成实验显示,EpCAM基因沉默组克隆形成率比空载组、空白对照组明显降低(p<0.05);MTT实验结果显示EPCAM基因沉默后细胞的增殖能力明显降低(p<0.05);细胞划痕实验结果显示,EpCAM基因沉默组48h划痕宽度明显大于空载组和空白对照组(P<0.05);Transwell实验结果显示基因沉默组中穿过transwell小室的细胞数较空载组和对照组显著减少(P<0.05);流式细胞术分析肿瘤细胞周期分布变化,结果显示基因沉默组肿瘤细胞周期多处于G2期(P<0.05),空载组及对照组肿瘤细胞周期多处于G1期(P<0.05),干扰组、空载组及对照组肿瘤细胞S期数量无明显差异(P>0.05);细胞粘附实验显示,基因沉默组细胞粘附性比空载组、空白对照组明显降低(p<0.05)。3.裸鼠体内成瘤实验显示,EpCAM基因沉默组肿瘤体积及质量均明显小于空载组、空白对照组(p<0.05)。干扰组肿瘤EpCAM的表达阳性率显著低于对照组、空载组(P<0.05),干扰组肿瘤E-cadherin的阳性表达率显著高于对照组、空载组(P<0.05),干扰组肿瘤细胞凋亡率显著高于对照组、空载组。结论:1.成功构建EpCAM基因shRNA慢病毒载体及EpCAM稳定沉默的肝母细胞瘤HuH-6细胞系。2.EpCAM可能通过影响肝母细胞瘤细胞的增殖、迁移和侵袭而促进肝母细胞瘤的增殖和转移。