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植物寄生线虫(Plant Parasitic Nematodes,Phytonematodes)是指寄生于植物的各组织中,影响植物正常生长发育,造成植物出现疾病症状的一类线虫。它通过口针刺入植物细胞、分泌效应蛋白(Effector Protein),修改植物细胞、摄取营养物质以维持自身生长发育。控制效应蛋白表达的效应因子(Effector),广泛纯在于植物寄生线虫中,在线虫整个生长发育及侵染寄生中起到重要作用。深入研究线虫效应因子功能,了解线虫与宿主植物间的作用机制,对如何防治线虫侵染宿主植物,减少经济损失具有重要意义。目前,对线虫效应因子研究已成为线虫研究的热点。本实验以贝西滑刃线虫(Aphelenchoides bessseyi Christie)为供试材料,从效应因子Ab-Gpero(贝西滑刃线虫谷胱甘肽过氧化物酶基因)入手,利用RACE扩增法,克隆了贝西滑刃线虫上的该基因,利用原位杂交技术定位基因,了解效应因子的功能位置,利用RNAi技术分析其功能,了解效应因子在贝西滑刃线虫繁殖、侵染方面的作用。为将来开展贝西滑刃线虫生物防治工作提供新思路。 目的基因的克隆。提取贝西滑刃线虫RNA,构建第一链cDNA,利用生物信息学筛选靶标基因的EST序列,设计特异性引物,通过PCR、测序及NCBI中Blast比对确定为所研究基因的部分序列(Ab-Gpero片段基因大小为408bp)。根据获得的序列,设计新引物,用RACE法克隆目的基因cDNA全长序列,进行基因分析。 原位杂交分析Ab-Gpero基因的表达位置。根据目的基因设计特异探针,利用原位杂交确定基因表达位置。结果显示Ab-Gpero基因的表达位置在背食道腺上,分析了基因功能位点。 RNAi分析Ab-Gpero基因的功能。利用T7RNA聚合酶合成dsRNA,纯化后将dsRNA侵泡导入供试贝西滑刃线虫体内,dsRNA量与线虫样量相当。24小时后,将dsRNA处理的线虫和未经dsRNA处理的线虫转接到胡萝卜培养基上,观察其对胡萝卜愈伤组织的侵染状况。发现dsRNA处理的长势比未处理的长势好,显示了Ab-Gpero基因在线虫侵染寄生方面发挥着重要作用。