论文部分内容阅读
龋病是一种细菌感染性疾病,其中变异链球菌族细菌是其主要病原菌。主要包括变异链球菌(S.mutans)和远缘链球(S.sobrinus,又称茸毛链球菌、表兄链球菌)。粘附是变异链球菌族细菌致龋的基础,变异链球菌表面蛋白(surface protein antigen, SpaP)和葡聚糖结合蛋白(glucan-binding proteins, Gbp)是变异链球菌重要的粘附毒力因子,参与介导细菌在牙面的粘附,并具有良好的免疫原性,能够诱导机体产生保护性免疫应答。本实验拟将变异链球菌表面蛋白SpaP的P区和葡聚糖结合蛋白Gbp的编码基因spap-P和gbd嵌合到真核表达载体pVAX1中,构建真核重组质粒pVAX1-SPG。并将重组质粒转染哺乳动物细胞观察目的蛋白的表达,为进一步的动物实验研究提供物质基础。方法：本研究共分为两个实验实验一重组真核表达质粒pVAX1-SPG的构建以变异链球菌基因组DNA为模板,PCR扩增变异链球菌表面蛋白P区编码基因spap-P和葡聚糖结合蛋白GbpA的GBD编码基因gbd,分别将目的基因spap-P和曲d定向克隆到真核载体pVAX1中,构建重组质粒pVAX1-SP、pVAX1-GG。经KpnⅠ和EcoRⅠ双酶切验证目的基因定向插入真核载体pVAX1后,重新设计引物,将基因spap-P的和gbd嵌合到真核载体pVAX1中,构建重组质粒pVAX1-SPG,酶切鉴定和测序分析。实验二重组真核表达质粒pVAX1-SPG在293T细胞中的表达将重组质粒pVAX1-SPG通过Lipofectamine 2000转染至真核细胞293T中,SABC法检测重组质粒pVAX1-SPG能否在真核细胞中表达目的蛋白。结果：(1)经PCR扩增出1.2kb的变异链球菌表面蛋白P区编码基因spap-P和1.18kb的葡聚糖结合蛋白GbpA的GBD编码基因gbd；重组质粒pVAX1-SP经KpnⅠ、EcoRⅠ双酶切后电泳可见3.0kb和1.2kb两条带,重组质粒pVAX1-GG经KpnⅠ、EcoRⅠ双酶切后电泳可见3.0kb和1.18kb两条带,重组质粒pVAXl-SPG经KpnⅠ、EcoRⅠ双酶切后电泳可见3.0kb和2.4kb两条带,目的片段大小与设计相符；测序验证重组质粒pVAX1-SPG中目的基因片段核苷酸序列同源性达99%,插入位置正确,读码框未发生改变。(2)重组质粒pVAX1-SPG转染真核细胞293T后,经SABC法检测,实验组细胞浆内有呈棕黄色的表达产物,而对照组细胞浆内无着色。结论：成功构建了携带有变异链球菌表面蛋白表面SpaP的P区编码基因spap-P和葡聚糖结合蛋白的GBD编码基因gbd的真核质粒pVAX1-SPG,重组表达质粒转染真核细胞293T后,能够正确表达目的蛋白。