晚期糖基化终末产物(advanced glycation endproducts,AGEs)主要是蛋白质(或氨基酸)的游离氨基与还原糖(如葡萄糖、果糖等)的羰基经过非酶褐变途径产生的一系列复杂的有害产物,主要包括羧甲基赖氨酸(carboxymethyllysine,CML)、羧乙基赖氨酸(carboxyethyllysine,CEL)、吡咯啉(pyrroline,Pyr)、戊糖素(pentosidine,Pento-s)等。人体内AGEs的积累可能引起衰老和氧化应激,增加多种疾病发生的风险。研究不同热加工条件、不同的食品成分(包括自然存在的及添加成分)对AGEs产生的影响机制,对于进一步研究如何控制食品加工过程中AGEs的产生,提高食品的质量与安全具有十分重要的意义。因此,本课题的研究目的:(1)建立一种灵敏、准确的肉中自由态及结合态CML、CEL的HPLC-MS/MS检测方法;(2)研究热处理(巴氏杀菌、商业杀菌)对牛肉、猪肉和鸡肉中AGEs产生的影响;(3)明确肉的成分(蛋白、脂肪)、调料(糖)和添加剂(亚硝酸盐、异抗坏血酸盐)对热加工肉中AGEs产生的影响。主要研究内容及结果如下:1.建立了利用HPLC-MS/MS测定牛肉、猪肉、鸡肉中自由态和结合态CML、CEL含量的检测方法。自由态CML、CEL的提取采用三氯乙酸水溶液与肉样混合,经均质离心后,上清液再加入正己烷去除脂肪;结合态CML、CEL的提取采用硼氢化钠溶液将样品还原,经氯仿-甲醇溶液去除脂肪后,沉淀的蛋白用盐酸水解。将上述上清液和水解液分别过混合型阳离子交换小柱萃取净化,样品溶液在亲水作用色谱柱中以甲醇-水(均含乙酸铵和甲酸)为流动相进行梯度洗脱。选用电喷雾正离子(ESI+)模式电离,多反应监测模式进行串联质谱分析。以内标法定量,d4-CML为内标物,分析时间为12 min。本方法仪器检出限CML为4μg/L,CEL为5μg/L;定量限CML为12μg/L,CEL为15μg/L。测定牛肉、猪肉和鸡肉中结合态CML添加回收率为66.9%-124.3%,结合态CEL为71.6%-120.6%,自由态CML为81.6%-127.2%,自由态CEL为71.6%-116.7%。本方法操作简便、快速、灵敏度高、精密度好,为进一步研究食品中CML和CEL的产生机理及其影响因素提供了有效的检测方法。2.应用上述HPLC-MS/MS法研究商业杀菌处理(121℃,10 min)对不同品牌和部位的牛肉(后腿、眼肉、牛五花)、猪肉(后腿、里脊、猪五花)、鸡肉(鸡腿、鸡胸)中自由态和结合态CML、CEL形成的影响。结果发现,牛肉和猪肉中自由态AGEs占总AGEs含量的比例比较低,新鲜肉中低于15%,商业杀菌肉中低于8%。但是新鲜鸡胸肉中含有较高含量的自由态CEL,为7.12±9.98 mg/kg(n=13),而猪肉和牛肉由于生物学差异自由态CEL含量仅为0.19±0.09 mg/kg(n=9)和0.44±0.19 mg/kg(n=9)。商业杀菌处理对各种肉中自由态CML和CEL的含量没有显著影响,但是促进了结合态CML和CEL的形成,肉中结合态CML、CEL含量提高了0.6-3.6倍。不同来源肉中自由态和结合态CML、CEL的含量不尽相同,并且肉的品牌和部位(鸡胸除外)对肉中AGEs含量的高低没有显著影响。通过此研究发现,牛肉和猪肉中的蛋白和脂肪含量对商业杀菌过程中结合态AGEs形成的影响很小或没有影响。3.研究了巴氏杀菌条件(65-100°C,0-60 min)对牛肉中结合态CML和CEL产生的影响,并对不同温度下CML和CEL的产生速率进行动力学分析。研究发现,牛肉中CML和CEL的含量随加热温度的提高和时间的延长而稳定地提高。加热温度越高,加热时间越长,CML和CEL生成量越多。在65-100°C加热60 min后,牛肉中CML含量增加了60%-361%,CEL含量增加了72%-301%。CML(2.76-19.96 mg/kg)和CEL(2.32-11.89 mg/kg)的含量具有显著的线性相关性,R2=0.920。在65-100°C加热0-60 min的热处理条件下,牛肉中的CML和CEL的产生基本上符合零级反应动力学方程(CML:R2=0.851-0.995,化学反应速率为0.031-0.224 mg·kg-1·min-1;CEL:R2=0.907-0.971,反应速率为0.044-0.118mg·kg-1·min-1),CML的化学反应活化能为61.01 k J/mol,CEL为29.21 k J/mol。这说明CML和CEL的含量本身不影响其产生速率。4.研究了不同添加量的亚硝酸钠(50-150 mg/kg)和D-异抗坏血酸钠(100-1000mg/kg)对牛肉热加工(100oC,0-60 min)过程中自由态和结合态CML、CEL产生的影响。亚硝酸盐和抗坏血酸盐是肉类食品加工中常会用到的添加剂,可能会影响AGEs的形成。研究发现,牛肉中自由态AGEs占总AGEs含量的1.1-8.7%。随加热时间的延长,自由态AGEs的比例会降低。亚硝酸钠的添加对自由态AGEs的产生几乎没有影响,但是自由态CML和CEL含量随异抗坏血酸盐浓度的升高有略微降低。尽管异抗坏血酸盐的添加会促进、亚硝酸盐的添加会抑制结合态CML、CEL的产生。但是,这二者的添加要远低于加热对AGEs形成的影响。5.研究了不同添加量的牛脂肪(8.3-32.4%)对牛肉热加工(100℃,0-60 min)过程中自由态和结合态CML、CEL产生的影响。研究发现,相对于牛肉的蛋白含量,自由态CML和CEL的含量不受其脂肪含量的影响;而结合态CML、CEL的含量随脂肪含量的升高而增多,但是这种差异并不是很明显。脂肪含量越高对应的蛋白含量越低,相对于样品质量的AGEs的含量也越低。在同等的加热条件下,不同脂肪含量的牛肉之间结合态CML或CEL含量没有显著性差异,但是可以看出高脂肪含量的牛肉中结合态CML或CEL含量要高于低脂肪含量的牛肉,并且脂肪含量越高,相对于蛋白含量的结合态AGEs含量越高。6.研究了不同添加浓度(1%、3%、9%)的葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖对猪肉热加工(121℃,5-30 min)过程中结合态CML和CEL产生的影响。在热加工及贮藏的过程中,还原糖的羰基可能和肉中蛋白质的氨基发生糖基化反应,或者糖高温降解产生的二羰基化合物与氨基反应,从而促进肉制品中CML和(或)CEL的生成。研究发现,葡萄糖、果糖、乳糖会促进热加工猪肉中CML、CEL的产生,但蔗糖对二者产生的影响很小或几乎没有;糖浓度越高,CML和CEL产生量越多;添加单糖的猪肉CML和CEL的产生量要高于添加二糖的猪肉;相同浓度的葡萄糖和果糖,添加葡萄糖的肉中CML含量高于(而CEL含量低于)添加果糖的猪肉;猪肉表面颜色L*、a*、b*值与CML、CEL含量具有较好的相关性,(R2:AGEs vs.L*为0.838-0.956;AGEs vs.a*为0.674-0.931;AGEs vs.b*为0.676-0.941)。猪肉AGEs含量与颜色的相关性表明美拉德反应是影响商业杀菌猪肉中AGEs形成及颜色变化的主要因素,可以通过猪肉颜色的变化预测其商业杀菌过程中AGEs产生量的变化。本研究建立了一种灵敏、准确的肉类中自由态和结合态CML、CEL含量的HPLC-MS/MS检测方法,研究了受加热条件(巴氏杀菌和商业杀菌)、肉的组成(蛋白和脂肪)、食品成分(糖)和食品添加剂(亚硝酸盐和异抗坏血酸盐)影响的不同肉中AGEs的含量。本文系统性的研究有助于人们总体了解巴氏杀菌和商业杀菌条件对复杂食品体系中AGEs形成的影响,更重要的是为优化传统和新型热处理产品的质量提供数据参考,研究具有重要的理论和实践价值。