研究背景:单细胞测序技术作为近年来新兴技术,非常有助于我们深入理解心脏在发育、稳态和疾病中的特征和变化。然而,三个主要问题阻碍了这项技术在心脏研究领域的应用:心肌细胞难以解离,因此难以获得高活率的心肌细胞单细胞悬液、解离带来的应激相关基因的激活、最重要的是心肌细胞太大导致无法用高通量的捕获平台进行单细胞捕获。为了解决这些问题,单细胞核测序技术应运而生。然而,单细胞核测序是否能替代单细胞测序在心脏领域广泛运用,尚未系统阐明。且没有研究对心脏组织单细胞核测序的测序质量、偏倚、分辨率以及和单细胞测序的比较进行系统性的评价。在此,我们分别在bulk和single-cell层面比较了心脏细胞细胞核和全细胞的转录组差异及其后续应用价值。研究方法及结果:一、Langendorff法解离成年小鼠心肌细胞方法优化为了解决Langendorff仪器过于复杂,细胞分离操作难以掌握,从而影响了所得细胞的活力和纯度,无法满足测序要求,并且重复性差、批次差异大的问题,我们提出了一个详细的优化方案,包括改良的Langendorff设备和简化的实验操作方法和流程,用重力作为解离成年小鼠心脏的灌注压力。该方法易于学习和操作,且提高了从成年小鼠心脏中分离目标细胞群的活率和纯度。二、成年小鼠心肌细胞核提取方法优化为了更好地比较心肌细胞核与全心肌细胞的转录组差异,我们对提取心肌细胞核的流程和实验方法进行了优化。我们首先用Langendorff的方法分离得到纯化的成年小鼠心肌细胞,然后将心肌细胞分为两份,一份作为全心肌细胞组,另一份用来提取心肌细胞核。这样做的好处在于,尽可能的让两组样本经历同样的样本制备流程,从而有效避免获取样本过程不同对实验结果造成的影响,以更真实的展示心肌细胞核和全心肌细胞的差异。三、Bulk RNA-seq比较成年小鼠心肌细胞和心肌细胞核的转录组差异我们利用优化的心肌细胞分离方法和心肌细胞核提取方法对成年小鼠心肌细胞及核RNA进行提取纯化,并进行二代链特异性bulk RNA-seq。我们研究了心肌细胞核与全细胞之间相对转录本丰度的差异,并着重展示细胞核或全细胞中更为富集的基因和基因类别。我们的研究结果还提供了对心肌细胞中核编码线粒体基因的亚细胞定位的重要见解。四、单细胞水平比较心脏细胞和心脏细胞核的转录组差异我们开发了一套无偏倚的组织处理和单细胞核转录组测序的流程来解析心脏细胞特异性的特点,同时在人心脏组织中进行了应用。我们的方法在多个物种的心脏组织中证明可行,且获得的测序质量优于既往文献。基于此,我们运用该方法在成年人心脏组织中进行单核测序并与单细胞测序进行比较,揭示二者异同,为技术平台选择对心血管疾病认知的差异提供新的见解。结论通过如上实验,我们获得了如下结论:1)提供了一个优化的Langendorff灌注系统和稳定的操作方法。2)建立了一个创新性的在悬浮的心肌细胞中提取心肌细胞核的方法。3)我们的数据为成年小鼠心肌细胞中RNA转录物的亚细胞定位提供了第一个资源。我们显示全细胞和细胞核之间mRNA和IncRNA的表达存在显著差异。我们还提供了关于NEMP转录物的亚细胞定位的新知识,这可以为线粒体基因表达调控提供更深入的见解。我们的数据表明,在心脏疾病样本中使用核RNA作为基因表达分析的来源作为全细胞的替代可能会使转录水平的分析结果产生偏差。4)snRNA-seq和scRNA-seq在细胞分群和亚群分析上具有一致性;snRNA-seq较scRNA-seq能够有效减少应激基因的干扰;snRNA-seq能够对人心脏细胞进行无偏倚表征。