国内外研究数据显示，血管相关性疾病位于国民死亡原因之首，其中脑卒中作为一种高致死、高致残性疾病，给各国家庭和社会带来了巨大的经济损失和精神负担。然而，目前临床对脑卒中的治疗尚缺乏有效的治疗措施。缺血/低氧预适应(I/HPC)可提高组织器官对继发严重缺血/低氧损伤的耐受，对这一内源保护机制的研究，可为脑卒中临床治疗打开新视野。近年研究表明，HPC形成的众多可能机制均涉及蛋白激酶C (PKC)的参与，且本实验室前期研究发现，经典型PKC II(cPKC II)、γ (cPKCγ)和新奇型PKC (nPKC)的膜转位(激活)水平增高参与了小鼠脑HPC形成的同时，cPKCγ及其相互作用蛋白在HPC保护缺血脑组织中发挥着重要作用。据此，本实验拟利用小鼠成神经瘤细胞(N2a)的单纯低氧和氧糖剥夺(OGD)模型，来模拟脑HPC和缺血损伤，从离体水平上进一步证实cPKCγ在HPC对抗N2a细胞OGD损伤中作用并探讨其可能的细胞分子机制。实验选用小鼠N2a成神经瘤细胞，常规培养于含有10%胎牛血清的DMEM完全培养基中，并置入37℃、含21%O2/5%CO2/74%N2常氧混合气体、饱和湿度培养箱内培养，24h换液，2~3d传代。细胞HPC模型：将N2a细胞培养于含有10%胎牛血清的DMEM(含高葡萄糖)培养基中，置于37℃、1%O2/5%CO2/94%N2低氧气体、饱和湿度下培养20min。细胞OGD模型：细胞培养于无血清的DMEM(无葡萄糖)培养基中，置于37℃、1%O2/5%CO2/94%N2低氧混合气体、饱和湿度，根据实验需要，培养2、3或4h，然后复糖复氧24h。cPKCγ抑制剂Go6983在细胞进行HPC前即刻加入，并在细胞培养基中保持终浓度为6nmol/L。在观察HPC对OGD细胞的保护作用实验中，N2a细胞先经过HPC (20min)预处理后复氧6h，再进行OGD3h处理。本实验用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)比色法、乳酸脱氢酶(LDH)漏出率、原位末端标记(TUNEL)和蛋白印迹(Westernblot)几种方法，分别检测N2a细胞损伤、坏死、凋亡和自噬水平。实验数据使用单一因素方差分析(One way ANOVA)和Bonferroni显著性检验进行统计学处理，数值以均数标准误(X SEM)表示，其中P<0.05为差异显著。实验结果如下：1． cPKCγ和HPC对OGD致N2a细胞缺血损伤的影响将N2a细胞进行2或4h氧糖剥夺(OGD)，然后复糖复氧24h。MTT结果表明，OGD2和4h可使N2a细胞的生存率分别降至(79.0±2.1)%和(36.9±2.0)%；LDH漏出率结果显示，OGD2和4h组的细胞死亡率明显增高(P<0.05，每组n=6)。为了便于观察cPKCγ抑制剂Go6983和低氧预适应(HPC)对OGD致N2a细胞凋亡、自噬和坏死的影响，如下实验均采用OGD3h、复糖复氧24h作为模拟细胞缺血损伤的刺激。细胞生存率结果表明，HPC(20min)可明显改善OGD3h对N2a细胞的损伤作用(P<0.05,每组n=16)，而cPKCγ抑制剂Go6983(6nmol/L)则明显解除HPC对OGD细胞的保护作用(P<0.05,每组n=16)。2．cPKCγ和HPC对OGD致N2a细胞凋亡的影响细胞TUNEL染色结果示，OGD3h可明显增加N2a细胞的凋亡数目(P<0.05，每组n=6)，但单纯HPC (20min)和cPKCγ抑制剂Go6983+HPC均不能明显地影响OGD3h的细胞凋亡水平。提示cPKCγ激活、HPC对OGD3h细胞的保护作用均与细胞凋亡无关。3．cPKCγ和HPC对OGD致N2a细胞自噬的影响利用Western blot检测LC3II与LC3I的比例(LC3II/I)，来反映N2a细胞的自噬水平。结果可见，与常氧对照组(Control)相比，OGD3h可明显提高N2a细胞的自噬水平(P<0.01，每组n=6)；与OGD3h组相比，抑制cPKCγ激活(Go6983)和HPC+Go6983均可明显降低OGD3h细胞的自噬水平(P<0.05，每组n=6)，而单纯HPC(20min)虽使OGD3h细胞的自噬水平有所降低，但无统计学意义。提示cPKCγ激活参与了OGD3h致N2a细胞的自噬改变，而HPC对OGD3h细胞的保护作用可能与自噬变化无关，但为什么HPC+Go6983降低OGD3h细胞的自噬水平要比单纯cPKCγ抑制的作用更显著，尚有待于进一步的实验分析。4．cPKCγ和HPC对OGD致N2a细胞坏死的影响应用乳酸脱氢酶(LDH)漏出率，来检测N2a细胞的坏死水平。结果表明，HPC(20min)明显改善OGD3h致N2a细胞坏死的程度(P<0.05，每组n=16)，而cPKCγ抑制剂Go6983则解除了HPC的这种保护作用(P<0.05，每组n=16)。提示HPC对OGD3h细胞的保护作用主要是通过cPKCγ激活，来减轻N2a细胞的坏死水平。综上所述，本实验在离体细胞水平上进一步证实了cPKCγ在HPC改善N2a细胞OGD损伤中的重要作用，且这种作用主要是通过减轻OGD细胞的坏死水平来实现N2a细胞对OGD损伤的耐受。所获成果在离体细胞水平上丰富了人们对缺血/低氧预适应(I/HPC)提高组织器官对继发严重缺血/低氧损伤的耐受这一内源保护机制的认识，同时可为临床脑卒中提高潜在的治疗靶点。