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乌拉尔甘草是我国应用最为广泛的一种药用植物,具有广泛的医用价值、生态价值和工业价值。近年来,甘草资源受到严重破坏,野生资源日益枯竭,遗传多样性流失严重。因此研究甘草种质资源的保存方法,对野生甘草资源的保护利用有着重要的意义。用种子超低温保存种质资源是目前种质资源保存中最简便而有效的方法。本研究选用了三份不同活力的甘草种子,研究种子本身活力、解冻温度和冷冻环境对于超低温保存效果的影响;并进一步研究超低温保存后种子在生理生化水平上的稳定性;检测了POD、EST、SOD、CAT四种酶的同工酶图谱,在表达水平上检测遗传稳定性;用30个引物对基因组DNA进行ISSR扩增检测,从分子水平上进行遗传稳定性的检测。结果表明:
1、离心管密封、快速冷冻法、-20℃低温慢速解冻的方法,可以用于超低温保存乌拉尔甘草的硬实种子。无论是发芽试验结果,生理生化稳定性(ATP,MDA,O2,POD,SOD,CAT)结果及遗传稳定性(POD,EST,SOD,CAT同工酶谱)都证明该处理下的种子活力没有降低,生理生化和遗传稳定,是保存乌拉尔甘草的硬实种子的适合方法。
2、解冻温度和冷冻环境对超低温保存都存在影响,解冻温度和解冻速度越低,越有利于种子活力的保持;与液氮隔绝的冷冻环境要比直接浸入液氮中有利于保持种子活力,两个因素中,解冻温度对冻后种子活力的影响更大。
3、种子本身活力对甘草种子超低温保存效果存在影响,这种影响的本质在于种子初始活力决定解冻后种子的修复能力强弱;同时也是说明甘草种子可以忍耐一定的超低温伤害而不影响生活力。
4、超低温可以对比较剧烈的处理中种子的POD和SOD酶表达水平上产生影响,至少证明在不合适的液氮处理方法中超低温会造成遗传物质在表达上的损伤。
5、30条ISSR引物有14条能扩增出多态性,其中引物4和28扩增出差异带,由于方法和材料的局限,本实验中尚不能对超低温是否在分子水平上造成损伤做出结论,有待进一步研究。