胰岛素样生长因子I（Insulin like growth factor, IGF-I）是一类具有细胞分化和增殖功能，并具有胰岛素样作用的多肽，由于IGF-I具有降低血糖的作用，最初就被设想用于糖尿病的治疗，以控制血糖和血脂。许多研究都已证实IGF-I可辅助胰岛素改善胰岛素依赖型（IDDM），即Ⅰ型糖尿病病人的合成代谢状况，并减少胰岛素过量带来的危险性。IDDM患者给予不同剂量的IGF-I后，胰岛素的用量减少，糖化血红蛋白（HbAlc）水平降低，同时,GH/IGF轴紊乱有较明显改善，这对于预防和缓解以增殖病变为主的并发症亦起到一定作用。此外，IDDM患者体内普遍存在T淋巴细胞数量减少和活性的降低，以致β细胞大量损坏。IGF-I治疗后，CD4+、CD8+细胞增加，同时抑制CD4+细胞的功能，保护β细胞，从而矫正糖尿病时的免疫异常。胰岛素不敏感或抵抗是Ⅱ型糖尿病（非胰岛素依赖型糖尿病NIDDM）的特征，也是影响其治疗的一个重要因素。IGF-I通过自身受体介导降糖效应，提高组织对胰岛素的敏感性，降低血糖和血清胰岛素浓度，改善患者的糖耐量异常。此外，IGF-I的应用还可使血甘油三酯下降，内脏脂肪含量减少，血PAI-1和胶原下降，提示IGF-I的使用对减少心血管系统的远期并发症也有帮助。因而它作为降糖因子可用于需要胰岛素治疗的IDDM患者，也可用于NIDDM患者，特别是在控制伴有胰岛素抵抗的糖尿病患者的血糖方面很有价值，对胰岛素抵抗并发酮症酸中毒患者，IGF-1的降糖疗法可能是最好的。目前，重组人IGF-I制剂在临床上已作为胰岛素的辅助用药，试用于糖尿病、糖尿病并发症、胰岛素抵抗综合征、侏儒症、神经系统疾病，肾衰等多种顽症，并取得了较好的疗效。然而外源性IGF-I治疗并不能满足正常生理需要，而且存在肌肉、关节疼痛，面红，水肿，头痛和疲倦等副作用，同时长期注射给患者带来一定的痛苦和不便。因此本课题拟克隆人IGF-1基因，构建真核表达载体，转染COS-7<WP=4>细胞，并运用多种方法检测自行克隆的hIGF-1基因的转录，翻译和体外蛋白表达情况，验证表达蛋白的生物活性；同时，为达到长期稳定的表达，我们还构建了hIGF-1的腺相关病毒载体，在得到高病毒滴度的病毒粒子后，感染骨髓基质细胞，以此为运载细胞将hIGF-1导入糖尿病鼠动物模型，观察其对糖尿病及其并发症的治疗作用。主要研究结果如下：1. 人IGF-1基因的克隆和真核表达载体的构建从胎儿肝脏组织中提取总RNA，通过RT-PCR的方法得到了特异的710bp条带。将其连接于pUCM-T载体送测序，结果与GenBank(M29644.1)登陆的序列完全一致，说明正确克隆到人IGF-1cDNA全序列。然后，将测序正确的片断连于真核表达载体pCI-neo，EcoR I和Xba I双酶切证实pCI-neo/hIGF-1表达载体构建成功。2．人IGF-1基因cRNA探针的制备和检测将hIGF-1基因亚克隆于带有噬菌体T7和沙门氏菌噬菌体SP6启动子的载体pGEM-3zf中，以制备合成地高辛精标记cRNA探针的模板。分别用EcoRI 和Xba I酶切后，用玻璃奶纯化回收得到正义和反义的模板。用体外转录法，合成地高薪精标记hIGF-1cRNA探针。斑点杂交法检测所合成探针的浓度，正义，反义探针浓度分别为20ng/ul和30ng/ul。3．hIGF-1基因的真核表达及生物活性分析用脂质体转染法(LipofectAMIN)将重组的pCI-neo/hIGF-1质粒转染入COS-7细胞，72小时后，原位杂交和免疫组化可检测到hIGF-1在RNA和蛋白水平的表达，转染细胞及其上清中通过Western blot的方法，可见到14kD左右的条带。胰岛素刺激释放实验结果显示，胰岛细胞在含IGF-1的上清中培养48小时后，胰岛素分泌量显著增高。高糖组胰岛素释放量较低糖组显著增加，提示分泌至细胞外的hIGF-1可以促进胰岛细胞胰岛素的合成和释放。4．腺相关病毒载体的构建及稳定表达，hIGF-1细胞系的获得用基因重组方法构建携带hIGF-1的腺相关病毒载体pAAV/hIGF-1，用磷酸钙，脂质体及Fugen6转染的方法将pAAV/hIGF-1, pAAV-RC, phelper三种质粒共转染HEK293包装细胞系，结果证实对于HEK293细<WP=5>胞，磷酸钙法的转染效率最高。反复冻融法制备病毒上清，并用Millipore超微滤膜对其进行浓缩后，病毒滴度达到1012。用高病毒滴度的病毒上清感染骨髓基质细胞，分别用x-gal及免疫组化染色证实病毒的感染率达到60%以上，扩大培养后用于移植。5．hIGF-1工程细胞糖尿病治疗作用初探----体内试验用streptozotocin(STZ)制备糖尿病鼠模型，并将稳定表达hIGF-1的工程细胞以不同细胞数进行移植，结果证实只有当携带hIGF-1的细胞达到一定数量时(30×106)，也就是当hIGF-1达到一定剂量时才能发挥其生物学活性，起到降低血糖的作用。而糖尿病不接受治疗组和单纯骨髓基质细胞组血糖值无变化。IGF-1可通过自身受体和通过增加胰岛素的敏感性而发挥调节血糖的生物效应。此外，IGF-1对免疫系统，IGF/GH轴亦有调节作用，同时还可减少胰岛素过量导致的低血糖反应，因而它作为降糖因子可用于需要胰岛素治疗的IDDM患者，也可用于NIDDM患者，特别是在控制伴有胰岛素抵抗的糖尿病患者的血糖方面很有价值。因此克隆人的IGF-1基因为利用IGF-1基因治疗糖尿病奠定了基础。糖尿病时IGF-1基因表达水平的下